辽东湾毒害微藻潜在风险分布及环境关联

宋 伦,吴 景,李 楠,杜 静,王 昆,刘桂英,王 鹏



辽东湾毒害微藻潜在风险分布及环境关联

宋 伦1,2,吴 景2,李 楠2,杜 静2,王 昆2,刘桂英2,王 鹏1*

(1.哈尔滨工业大学环境学院,城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150090；2.辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁 大连 116023)

以18S rDNA V4区作为目标基因,利用自行设计的真核浮游植物鉴定引物V4(F/R),结合高通量测序技术,对辽东湾2014年四季海水中真核藻类多样性进行了检测.结果发现了辽东湾毒害藻类共29种,曾引发赤潮或褐潮的种类有19种,可导致鱼类大规模死亡的有8种,主要为甲藻门.有18种疑似为辽东湾新记录种,其中9种在中国海域未见报道;发现麻痹性贝毒(PSP)产毒藻8种,腹泻性贝毒(DSP)产毒藻2种,产虾夷扇贝毒素(YTX)产毒藻3种,神经性贝毒(NSP)产毒藻2种,溶血毒素(hemolysin)产毒藻13种,另外还有1种褐潮产毒藻(EPS).辽东湾检出的毒害藻类中有8种自养型、1种异养型、20种混合营养型藻类.麻痹性贝毒、虾夷扇贝毒素、溶血毒素在夏季风险较高,神经性贝毒在秋季风险较高,腹泻性贝毒在春、夏季风险均较高,辽东湾东西两岸是贝毒风险高发区.辽东湾春季水温对YTX、NSP产毒藻影响显著负相关;夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd对各产毒藻类影响显著正相关;秋季各环境因子对各产毒藻类影响不显著;冬季Zn、As、Oil、DIN对各产毒藻类影响显著正相关,水温对各产毒藻类影响显著负相关,各产毒藻类与环境因子关联性有待于进一步研究.

有毒微藻；贝毒；风险分布；环境关联；辽东湾

贝类或鱼类通过摄食有毒微藻等,经过生物累积和放大转化为有机毒素,从而危及水产品质量安全[1].目前已发现有麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)、神经性贝毒(NSP)、记忆缺失性贝毒(ASP)、虾夷扇贝毒素(YTX),以及雪卡毒素(西加鱼毒素, CTX)、刺尾鱼毒素(MTX)、溶血毒素(hemolysin)等[2-5],另外还存在一些导致鱼类大量死亡的藻类[6].由于检测方法相对滞后,毒藻风险预警研究相对迟缓,因此全面筛查目标海域有毒藻类及其数量分布尤为重要[7].而传统形态学镜检方法已不能满足微型、微微型有毒藻类的检测[8],高通量测序技术的发展极大地推动了小粒径藻类的高效检测研究[9-10],采用该技术,2014~2015年在辽东湾发现了褐潮致灾种抑食金球藻()[6]和外来有害微藻扩散迹象[11].

辽东湾是渤海最大的半封闭式海湾,是海洋生物重要的索饵场、产卵场、越冬场和洄游通道,但多年来超负荷承载陆源污染,近岸海域富营养化严重,有毒有害赤潮、褐潮频发,贝毒中毒事件时有发生[12-13].目前辽东湾有毒藻类传统检测方法只记录了8种[14],作为有毒有害藻类风险研究背景数据极其匮乏,鉴于此,本研究采用高通量测序平台,结合生物信息学方法,以18S rDNA的V4区为目标基因筛查了辽东湾真核有毒有害微藻种类[15],同时分析了其与环境因子的相关性,为贝毒风险预警研究提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 样品采集、制备与质量控制

2014年在辽东湾海域网格化设置12个站位(图1),分别于2014年5月(春)、8月(夏)、10月(秋)、12月(冬)采集表层海水1L.样品首先经200 μm筛绢过滤去除大型浮游生物,然后用0.22 μm微孔滤膜收集真核浮游植物,最后将滤膜转移至1.5mL无菌离心管中,置于-20或-80 ℃冷冻保存、运输.站位选取主要依据《海洋调查规范》(GB/T 12763-2007)[16],主要考虑样品的区域代表性和均匀性.

图1 辽东湾采样站位示意

同期进行海水的水温(SST)、无机氮(DIN)[铵盐(NH4+)、硝酸盐(NO3-)、亚硝酸盐(NO2-)之和]、活性磷酸盐(SRP)、石油类(Oil)、化学耗氧量(COD)、重金属汞(Hg)、铅(Pb)、铜(Cu)、锌(Zn)、镉(Cd)、砷(As)等指标的监测.调查、监测、质量控制方法均参照《海洋调查规范》和《海洋监测规范》(GB17378- 2007)[17]执行.

1.1.1 基因组DNA提取 采用CTAB法提取微微型浮游植物宏基因组,将滤膜剪碎置于1.5mL离心管中,加入500μL CTAB裂解液(2% CTAB; 100mmol/L Tris-Cl,pH值为8.0;1.4mmol/L NaCl; 10mmol/L EDTA)和1μL β-巯基乙醇,5~10μL蛋白酶K,55℃裂解1~1.5h;12000r/min离心5min,取出液体置于新的离心管中,用酚氯仿抽提2次后,取上清液,加入2倍体积预冷的无水乙醇,沉淀2~3h,保留沉淀,使用75%乙醇清洗沉淀,得到浮游生物基因组DNA,利用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度,合格后置于-20℃冰箱保存备用.

1.1.2 18S rDNA可变区V4的PCR扩增 该研究应用的引物为自行开发的真核浮游植物18S rDNA的V4区基因扩增引物——V4(F/R).上游引物为V4-F序列5'-GCGGTAATTCCAGCT CCAATA-3',下游引物为V4-R序列5'-GATCCCCHWACTTT- CGTTCTTGA-3'[18].将引物连接适当的接头送往上海生工生物公司进行合成. PCR反应体系为50μL,包括PCR Buffer 5μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物(10μmol/L)各2μL、模板DNA 2μL、Taq DNA聚合酶2.5U,加适量灭菌水.扩增反应均在PE 9700型PCR仪(美国PE公司)上完成,反应条件:94℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸45s,共33个循环;72℃延伸5min. 1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,将检测合格的产物交由诺和致源生物信息科技有限公司,使用NEB Next® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)建库试剂盒进行文库的构建,构建好的文库经过Qubit定量(Thermo Scientific)和文库检测,合格后,使用Hiseq2500PE250模式进行上机测序.

1.2 数据分析

测序得到的原始数据使用FLASH软件进行拼接,参照Qiime软件质量控制流程将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据.利用Uparse(http: //drive5.com/uparse/)对有效数据进行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类,采用RDP Classifier方法与SILVA数据库(https: //www.arb-silva.de/,Version 108)对OTUs代表序列进行物种注释[19].根据相关研究,粒径相同的微藻序列数比例更接近于丰度比例[20],镜检同期水样中出现的所有浮游植物,筛选同站位与分子鉴定毒害藻类粒径大小相似的种类作为密度基准种类[13],通过序列数比测算潜在毒害藻类密度,相关公式:

式中:为某站某种毒害藻类密度,ind/L;为同一站位水样中与某种毒害藻类粒径大小相似的镜检藻类密度,ind/L;为某站位水样中密度基准藻类的序列数;为某站位毒害藻类的序列数.

采用相对密度(RA)计算毒害藻类各季节数量相对比例:

式中:n为潜在毒害藻类在站的密度,ind/L;为统计单元的总密度,ind/L.

对上述公式计算、数据分析、方差检验、等值线绘制均通过Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0软件完成.

2 结果

2.1 测序数据质量

通过IlluminaHiSeq 2500测序平台进行PE250模式测序,所得原始数据使用FLASH软件进行拼接,参照Qiime软件质量控制流程,将拼接后的序列经过截取、过滤得到有效数据.每个样品平均获得77297条原始序列,经过拼接和质量过滤,每个样品平均得到70604条序列,高质量数据占到91%以上,表明测得的数据准确可靠.各样品测序结果见表1.

表1 有效序列数及OTUs数统计

2.2 OTUs聚类和物种注释

为进一步分析表层海水样品中物种组成多样性信息,使用Uparse软件对所有样品的有效序列进行聚类分析,以97%的一致性将序列聚类成为OTUs种水平,每个样品平均获得378个OTUs,剔除原生动物OTUs数后,春、夏、秋、冬注释到种的浮游植物种类分别为150、187、183、195.

2.3 毒害藻类种属确定

采用RDP Classifier方法与SILVA数据库对OTUs代表序列进行物种注释,获得各个分类水平OUTs的注释信息,为了验证结果的可靠性,将测序获得的序列信息与NCBI数据库中信息进行二次比对,获得种水平信息,其NCBI中对应的序列号和相似度见表2.高通量测序获得29种毒害藻类部分18S rDNA序列片段长度为380bp左右,通过NCBI Blast比对,在18S rDNA基因序列中对应的位置为489~ 956bp,此部分序列相似度为97%~100%,拟合度期望值(E-value)均为0.

表2 辽东湾毒害藻类分布及生态特征

续表2

注:“-”表示未检出;“*”表示之前辽东湾没有发现,但在中国其他海域有报道,“#”表示在中国海域没有报道过;Hemolysin:溶血毒素,PSP-麻痹性贝毒,DSP-腹泻性贝毒,NSP-神经性贝毒,YTX-虾夷扇贝毒素; B:bloom-forming藻华, F:fish-killing噬鱼,T:toxic有毒, Mixo:mixotrophy混合营养,Auto: autotrophy自养, Hetero: heterotrophic异养.

2.4 毒害藻类筛查

根据相关文献筛查统计[5,21-24],此次检测发现毒害藻类共29种,其中有9种藻类在中国海域未见报道,包括甲藻门5种、定鞭藻门2种、金藻门2种;另有9种藻类在辽东湾海域未见报道但在中国其他海域已报道,包括甲藻门8种、定鞭藻门1种.

产麻痹性贝毒(PSP)有8种,分别为相关亚历山大藻、安氏亚历山大藻、伪亚历山大藻、李氏亚历山大藻、假性亚历山大藻伊姆裸甲藻、环节裸甲藻、微型裸甲藻.产腹泻性贝毒(DSP)有2种,分别为渐尖鳍藻和微小原甲藻.产虾夷扇贝毒素(YTX)有3种,分别为具刺膝沟藻多边舌甲藻、网状原角藻.产神经性贝毒(NSP)有2种,分别为短凯伦藻和日本纤囊藻.产溶血毒素(hemolysin)有13种,分别为红色赤潮藻、多纹膝沟藻、微小卡罗藻、斯迪克里亚藻、里氏金色藻、鱼腥棕囊藻、球形棕囊藻、约氏棕囊藻、波切棕囊藻、黄金色鞭毛藻、海洋卡盾藻、赤潮异弯藻.另外还有1种褐潮藻未知毒素,抑食金球藻,疑似含有胞外多糖(EPS).

检测结果中很多OTUs只能注释到属水平,例如膝沟藻属sp.,鳍藻属sp.,棕囊藻属sp.,卡尔藻属sp.,定鞭金藻属sp.,棕鞭藻属sp.和硅鞭藻属sp.等,由此可见,还有多种有毒藻类存在辽东湾海域,对水产品质量安全存在极大威胁.贝毒高发季节(春、夏)有毒有害藻类主要集中的区域(站位)见表2.

2.5 毒害藻类生态特征

根据筛查统计,曾引发赤潮或褐潮的种类有19种,可导致鱼类大规模死亡的藻类有8种,主要为甲藻门.营养模式统计发现,有8种自养型、1种异养型、20种混合营养型藻类.

春、夏季为辽东湾毒害藻类生长高峰期,贝毒含量较高,直接威胁水产品质量安全.麻痹性贝毒(PSP)春季风险高发区主要集中在辽东湾东侧瓦房店和旅顺外海(10、12号站位)、夏季集中在辽东湾中西部觉华岛海域(2号站位)、中东部瓦房店外海(10号站位)以及东南部大连旅顺海域(12号站位);腹泻性贝毒(DSP)主要集中在辽东湾的中西部海域(4、6号站位);神经性贝毒(NSP)主要集中在夏季辽东湾的南部海域(4、11号站位);虾夷扇贝毒素(YTX)主要集中在夏季辽东湾的中西部觉华岛海域、中东部瓦房店外海和东南部大连旅顺海域(2、10、11、12号站位);溶血毒素(Hemolysin)在辽东湾海域分布范围较广(4、5、6、7、9、10、11、12号站位).从种类优势度分析,凯伦藻属sp.(NSP,辽东湾中北部海域5号站)、黄金色鞭毛藻(Hemolysin,中东部营口海域5、9号站位)、鱼腥棕囊藻(Hemolysin,中部海域5、7号站位)、抑食金球藻(EPS,南部海域7、8号站位)对渔业生物风险隐患最大.

2.6 微藻毒素风险分布

麻痹性贝毒中毒后主要症状为舌头、嘴唇发木、四肢无力等,低剂量(0.15mg)即可使人毙命.辽东湾分子鉴定产麻痹性贝毒的藻类有8种,总密度四季分布见图2.

图2 麻痹性贝毒产毒藻季节分布

麻痹性贝毒产毒藻在辽东湾分布较广,四季所有站位均有检出,密度相对较高.春季检出密度分布在5.23~20.27×103ind/L之间,平均值为2.60× 103ind/L,最高值出现在10号站位,最低值出现在8号站位;夏季密度分布在0.17~8.28×103ind/L之间,平均值为2.02×103ind/L,最高值出现在2号站位,最低值出现在5号站位;秋季密度分布在9.19~44.69× 103ind/L之间,平均值为4.39×103ind/L,最高值出现在5号站位,最低值出现在12号站位;冬季密度分布在0.63~5.97×103ind/L之间,平均值为0.56×103ind/L,最高值出现在1号站位,2、4、9号站位均未超过400ind/L,其余站位均未超过50ind/L.

腹泻性贝毒中毒的主要症状为呕吐、腹泻,严重者可出现黄疸、急性萎缩性肝坏死.辽东湾分子鉴定产腹泻性贝毒(DSP)有2种,分别为渐尖鳍藻和微小原甲藻,秋、冬季未检出,春、夏季总密度分布见图3.

图3 腹泻性贝毒产毒藻季节分布

春季检出毒藻密度分布在0~1708.57ind/L之间,平均值为228.07ind/L,最高值出现在绥中近岸的4号站位,6、8号站位未检出,2、9、10号站位均超过100ind/L,其他站位均未超过60ind/L,辽东湾中部海域密度相对较低;夏季密度分布在0.01~655.08ind/L之间,平均值为144.03ind/L,最高值出现在西南侧的4号站位,其次为12号站位(578.11ind/L),最低值出现在5号站位,1、6号站位均超过100ind/L,其他站位均未超过50ind/L,辽东湾中东部海域密度相对较低.

虾夷扇贝毒素是一类含有2个磺酰基的脂溶性多环聚醚类化合物,会造成肝脏损伤、坏死.辽东湾分子鉴定产虾夷扇贝毒素的藻类有3种,总密度四季分布见图4.

虾夷扇贝毒素产毒藻在辽东湾分布较广,四季都有分布.春季检出密度分布在0~5436.36ind/L之间,平均值为1119.69ind/L,最高值出现在12号站位,6号站位未检出,高值区主要分布在辽东湾的东南侧大连近岸(10、11、12号站位密度均超过103ind/L),辽东湾中、西部海域密度相对较低;夏季密度分布在0.05~10589.88ind/L之间,平均值为2216.33ind/L,最高值出现在1号站位,最低值出现在5号站位,3、4、6、8、11号站位密度均超过200ind/L,高值区主要分布在辽东湾的西侧近岸和东南海域(1、2、12号站位密度均超过103ind/L),辽东湾中部和东北部海域密度相对较低;秋季密度分布在0.59~7797.54ind/L之间,平均值为862.07ind/L,最高值出现在5号站位,最低值出现在7号站位,4、9号站位密度均超过300ind/L,高值区主要分布在辽东湾的西侧近岸和东北部海域(2、5站位密度均超过103ind/L),辽东湾东南部海域密度相对较低;冬季密度分布在0.30~1289.12ind/L之间,平均值为127.47ind/L,最高值出现在辽东湾西北部的1号站位,其余站位均未超过70ind/L.

神经性贝毒是一类大环多醚类且极其耐热的神经毒素,可以引起鱼类大量死亡,当人吸入含有其毒素的气雾时也会引起咳嗽、呼吸困难等中毒症状.辽东湾分子鉴定产神经性贝毒的藻类有2种,总密度四季分布见图5.

神经性贝毒产毒藻在辽东湾分布较广,四季都有分布,秋季密度相对较高.春季检出密度分布在0~543.64ind/L之间,平均值为83.13ind/L,最高值出现在12号站位,2、6、8、9号站位未检出,高值区主要分布在辽东湾的东南侧大连近岸(10、11、12号站位密度均超过100ind/L),辽东湾中、西部海域密度相对较低;夏季密度分布在0~1058.99ind/L之间,平均值为148.21ind/L,最高值出现在1号站位,9号站位未检出,高值区主要分布在辽东湾的西侧近岸和东南海域(1、4、12号站位密度均超过200ind/L),辽东湾中部和东北部海域密度相对较低;秋季密度异常升高,分布在(0.47~1029.33)×103ind/L之间,平均值为95.54×103ind/L,最高值出现在5号站位,最低值出现在10号站位,高值区主要分布在辽东湾的东、西两侧海域(2、4、5、6、7、9、12号站位密度均超过103ind/L,其中2、4、9号站位密度均超过104ind/L,5号站位密度竟达到106ind/L),相对其他季节,秋季全海域密度普遍偏高;冬季密度回归正常,分布在0.01~125.77ind/L之间,平均值为13.47ind/L,最高值出现在辽东湾西北部的1号站位,其余站位均未超过20ind/L.

图4 虾夷扇贝毒素产毒藻季节分布

溶血毒素最早发现是由病原微生物所产生的,能导致机体红细胞及其他有核细胞裂解的毒素类物质.近些年发现,某些海洋微藻可引起鱼类大量死亡,可产生使动物血红细胞溶解破裂的溶血毒素.辽东湾分子鉴定产溶血毒素的藻类有12种,总密度四季分布见图6.

溶血毒素产毒藻在辽东湾分布较广,四季都有分布,密度相对较高.春季检出密度分布在6.46~ 18.33×103ind/L之间,平均值为2.81×103ind/L,最高值出现在10号站位,8号站位最低,高值区主要分布在辽东湾的东南侧大连近岸(2、5、9、10、11、12号站位密度均超过103ind/L),辽东湾中、西部海域密度相对较低;夏季密度分布在13.94~18.70× 103ind/L之间,平均值为6.55×103ind/L,最高值出现在6号站位,5号站位最低,高值区主要分布在辽东湾的西侧近岸和东南海域(除了5、9号站位,其余站位密度均超过×103ind/L,其中1、6、12号站位密度均超过104ind/L),辽东湾东北部海域密度相对较低;秋季密度分布在41.37~36.22×103ind/L之间,平均值为3.80×103ind/L,最高值出现在5号站位,最低值出现在10号站位,高值区主要分布在辽东湾的东、西两侧海域(2、4、5、9、12号站位密度均超过103ind/L,其中5号站位密度均超过104ind/L),辽东湾中南部海域密度相对较低;冬季密度分布在1.05~19.74×103ind/L之间,平均值为2.59×103ind/L,最高值出现在9号站位,最低值出现在10号站位,高值区主要分布在辽东湾的东、西两侧海域(1、9、12号站位密度均超过103ind/L,其中9号站位密度均超过104ind/L),辽东湾中部密度相对较低.

图5 神经性贝毒产毒藻季节分布

图6 溶血毒素产毒藻季节分布

2.7 毒害藻类环境关联

辽东湾各季节产毒藻类总密度与环境因子的相关系数见表3.分析发现,春季SST对YTX、NSP产毒藻影响显著负相关,夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd对各产毒藻类密度影响显著正相关,秋季各环境因子对各产毒藻类影响不显著,冬季Zn、As、Oil、DIN对各产毒藻类影响显著正相关,SST对各产毒藻类影响显著负相关.

表3 辽东湾产毒藻类密度与环境因子相关系数

注:“*”表示显著相关(P<0.05); “**”表示极显著相关(<0.01).

3 讨论

3.1 分子鉴定获得的藻类疑似新记录种

基因测序技术的快速发展突破了小粒径藻类传统形态学鉴定局限,提高了调查灵敏度、准确度和检测效率.辽东湾海域毒害藻类占所有注释种类22%,其中甲藻门占毒害藻类67%、定鞭藻门占20%、金藻门占10%、黄藻门占3%.注释到种的29种毒害藻类中,有18种在辽东湾海域未见报道,其中有9种在中国海域未见报道,甲藻门居多.例如本次检测出的新种斯迪克里亚藻,有侵噬鱼类细胞杀鱼的能力,曾于2004年在韩国庆南马山海域引起鱼类成群死亡.该藻之前在中国海域未见报道,本研究发现其在辽东湾主要分布在东西两岸,致灾风险较高,其危害后果严峻,本次检出的8种可导致鱼类大规模死亡的藻类应引起有关方面足够重视[25-26].

不可否认,新发现的藻类也可能是土著种,由于调查的偶然性和鉴定技术限制暂未被发现.例如,2008年中国海域发现了全沟藻属(sp.),并定种为尖尾全沟藻()[27],2012年,鉴定为纤细全沟藻(),并认为是首次发现.除此之外,玛氏骨条藻()之前被定为中肋骨条藻(),后来经鉴定[28],将其改为玛氏骨条藻.

本次检测获得的藻类DNA信息大部分未能注释到种,主要原因可能是由于某些种类很难培养,基因序列无法获得,造成18s rDNA数据库浮游植物种类不全,注释到种的成功率较低所致.关于分子鉴定的准确性尚有部分学者存有疑虑,主要影响因素有扩增区域的选择、引物的选择或组合、PCR的偏好性、扩增效率的差异、读长的清晰度或解析度和数据库的完善度等[29].但相比传统形态学镜检方式,对物种多样性的发掘已经提升了一个数量级,尤其对微型、微微型浮游植物的发现提供了科学手段,同时大大降低了形态学鉴定的人为主观误差.

3.2 毒害藻类生态特征及潜在风险

本次研究发现的毒害藻类除混合营养型、自养型、异养型等营养模式外,也出现了较多共生生态模式藻类,寄生性共甲藻目的OTU数目占总数20%,因数据库收录信息较少,绝大多数没有获得种水平的注释信息,光合共生甲藻五刺多甲藻在本次调查中也检测出其与硅藻共生.甲藻具有多种营养模式,包括自养型、异养型、混合营养型,能够在低光照条件下利用微小的溶解有机物满足其生长和繁殖,相对于光合自养型,混合营养型的浮游植物生态竞争力更强[30-31].

辽东湾麻痹性贝毒产毒藻夏季占比最高(42.50%),春、秋季次之(分别为27.67%、21.94%),冬季最低(8.88%),可见夏季为麻痹性贝毒高发季节,春、秋季也不容忽视,大连、营口、锦州、葫芦岛近岸都是麻痹性贝毒潜在高风险区;虾夷扇贝毒素产毒藻也是夏季占比最高(50.30%),春、秋季次之(分别为23.22%、19.14%),冬季最低(7.35%),与麻痹性贝毒分布规律一致,大连渤海近岸和葫芦岛近岸是虾夷扇贝毒素高风险区;腹泻性贝毒产毒藻只在春、夏季有检出,主要由渐尖鳍藻和微小原甲藻贡献,辽东湾东西两岸是腹泻性贝毒高风险区;神经性贝毒产毒藻秋季占绝对优势(88.54%),春、夏、冬分别为4.79%、6.04%、0.63%,秋季产毒藻密度主要由短凯伦藻贡献,可见秋季为神经性贝毒高发季节,辽东湾全海域都是高风险区;溶血毒素产毒藻夏季优势明显(56.44%),春、夏、冬组成相似,分别为17.36%、14.36%、11.83%,夏季产毒藻密度主要由鱼腥棕囊藻、红色赤潮藻、黄金色鞭毛藻、斯迪克里亚藻贡献,可见夏季为溶血毒素高发季节,辽东湾全海域都是高风险区.

3.3 毒害藻类生长的环境控制因子

由于调查站位数量所限,产毒藻类在各站位间差异较大,加之研究区域各环境因子差异不明显,本次统计分析的各产毒藻类密度与环境因子的相关性不高,也可能与产毒藻类生长密切相关的环境因子未获分析导致.

辽东湾产毒藻类的生长繁殖受水体中理化环境因子的综合影响,春季只有水温对YTX、NSP产毒藻影响负显著相关;夏季有机(COD、Oil)与无机(DIN)环境及部分重金属(Pb、Cd)对各产毒藻类影响显著正相关;秋季各环境因子对各产毒藻类生长繁殖影响较小;冬季部分重金属(Zn、As)对各产毒藻类影响均很显著,金属元素之间的协同作用显著地促进了产毒藻类的生长[32],Oil、DIN也刺激了溶血毒素产毒藻类的生长[33-34],而低水温限制了各产毒藻类的生长繁殖.由于辽东湾海域水体理化环境的多变性和年际差异性,往往会造成环境因子对产毒藻类群落结构影响的差异性变化[35].

4 结论

4.1 本次研究发现辽东湾毒害藻类共29种,曾引发赤潮或褐潮的种类有19种,可导致鱼类大规模死亡的有8种,主要为甲藻门.有18种疑似为辽东湾新记录种,其中9种在中国海域未见报道;发现麻痹性贝毒(PSP)产毒藻8种,腹泻性贝毒(DSP)产毒藻2种,产虾夷扇贝毒素(YTX)产毒藻3种,神经性贝毒(NSP)产毒藻2种,溶血毒素(hemolysin)产毒藻13种,另外还有1种褐潮产毒藻(EPS).

4.2 辽东湾检出的毒害藻类中有8种自养型、1种异养型、20种混合营养型藻类.麻痹性贝毒、虾夷扇贝毒素、溶血毒素在夏季风险较高,神经性贝毒在秋季风险较高,腹泻性贝毒在春、夏季风险均较高,辽东湾东西两岸是贝毒风险高发区.

4.3 辽东湾春季SST对YTX、NSP产毒藻影响显著负相关;夏季COD、Oil、DIN、Pb、Cd对各产毒藻类影响显著正相关;秋季各环境因子对各产毒藻类影响不显著;冬季Zn、As、Oil、DIN对各产毒藻类影响显著正相关,SST对各产毒藻类影响显著负相关,各产毒藻类与环境因子关联性有待于进一步发掘.

[1] 刘永健,刘 娜,刘仁沿,等.赤潮毒素研究进展 [J]. 海洋环境科学, 2008,27(增刊2):151-159.

[2] Pearse M C, Håkan E, Philipp H. Freeze-drying for the stabilisation of shellfish toxinsin mussel tissue () reference materials [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007,387:2475–2486.

[3] Suzuki T, Quilliam M A. LC-MS/MS analysis of diarrhetic shellfish poisoning (DSP) toxins, okadaic acid and dinophysistoxin analogues, and other lipophilic toxins [J]. Analytical Sciences, 2011,27(6):571- 584.

[4] Armi Z, Turki S, Trabelsi E, et al. Occurrence of diarrhetic shellfish poisoning (DSP) toxins in clams () from Tunis north lagoon [J]. Environ Monit Assess, 2012,184(8):5085-5095.

[5] 宋 伦,宋广军,王年斌,等.黄渤海产毒藻类及贝毒研究现状[J]. 水产科学, 2013,32(7):430-436.

[6] 宋 伦,刘卫东,吴 景,等.有害甲藻在辽东湾的时空分布[J]. 生态学报, 2017,37(4):1339-1345.

[7] 田 华. 麻痹性贝毒的累积、转化、排出过程及预警诊断指标研究 [D]. 青岛:中国海洋大学, 2009:1-93.

[8] 刘卫东,宋 伦,吴 景.环境样本中微型和微微型浮游植物高通量测序的引物优化[J].生态学报, 2017,37(12):4208-4216.

[9] Amaral Z L, Artigas L F, Baross J, et al. A global census of marine microbes.life in the world′s oceans: diversity,distribution and abundance [M]. Oxford:Blackwell Publishing Ltd., 2010:223-245.

[10] 于 杰.浮游生物多样性高效检测技术的建立及其在渤海褐潮研究中的应用 [D]. 青岛:中国海洋大学, 2014.

[11] 宋 伦,吴 景,宋永刚,等.褐潮致灾种抑食金球藻在辽东湾的分布 [J]. 环境科学研究, 2017,30(4):537-544.

[12] 宋 伦,毕相东.渤海海洋生态灾害及应急处置 [M]. 沈阳:辽宁科学技术出版社, 2015:175-210.

[13] Song Lun, Yang Guojun, Wang Nianbin, et al. Relationship between environmental factors and plankton in the Bayuquan Port, Liaodong Bay, China: a five-year study [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology. 2016,34(4):654-671.

[14] DB21/T 2254-2014 海洋贝毒预警监测技术规程 [S].

[15] Dong Shaojie, Bi Xiangdong, N.WANG, Song Lun, et al. Algicidal activities of Cladophora fracta on red tide-forming microalgae Heterosigma akashiwo and Gymnodinium breve. Allelopathy Journal, 2016,37(2):231-240.

[16] GB/T 12763-2007 海洋调查规范 [S].

[17] GB17378-2007 海洋监测规范 [S].

[18] 宋 伦,吴 景,刘卫东,等.渤海长兴岛海域微型和微微型浮游植物多样性 [J]. 环境科学研究, 2016,29(11):1635-1642.

[19] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P,et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research, 2013,41:590-596.

[20] Rao Fu, Jun Gong.Single cell analysis linking ribosomal (r)DNA and rRNA copy numbers to cell size and growth rate provides insights into molecular protistan ecology [J]. Journal of Eukaryotic Microbiology 2017,64:885–896.

[21] 刘瑞玉.中国海洋生物名录 [M]. 北京:科学出版社, 2008:301-870.

[22] 赵冬至.中国典型海域赤潮灾害发生规律 [M]. 北京:海洋出版社, 2010:1-389.

[23] 宋 伦,宋广军.辽东湾浮游植物生态特征研究 [M]. 沈阳:辽宁科学技术出版社, 2016:437-440.

[24] Xu Xin, Yu Zhiming, Cheng Fangjin, et al. Molecular diversity and ecological characteristics of the eukaryotic phytoplankton community in the coastal waters of the Bohai sea, China [J].Harmful Algae,2017, 61:13-22.

[25] Jeong H J, Kim J S, Park J Y, et al.n. gen., n. sp. (Dinophyceae) from the Coastal Waters off Southern Korea: Morphology and Small Subunit Ribosomal DNA Gene Sequence [J]. The Journal of Eukaryotic Microbiology, 2005,52(4):382-390.

[26] Jeong H J, Kim J S, Kim J H, et al. Feeding and grazing impact of the newly described heterotrophic dinoflagellateon the harmful alga[J]. Marine Ecology Progress Series, 2005,295:69-78.

[27] Xing Xiaoli, Lin Xuyin, Chen Changping,et al.Observations of several cryptomonad flagellates from China Sea by scanning electron microscopy[J]. Journal of Systematics Evolution, 2008,46(2):205- 212.

[28] Sarno D, Wiebe H C F K, Linda K M, et al. Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae). II. An assesment of the taxonomy of S. costatum-like species with the description of four new species[J]. Journal of Phycology, 2005,41(1):151-176.

[29] 王雪芹,王光华,乔 飞,等.高通量测序及其在食物网解析中的应用进展 [J]. 生态学报, 2017,37(8):2530-2539.

[30] 宋 伦,宋广军,王年斌,等.辽东湾网采浮游植物粒级结构的胁迫响应[J]. 中国环境科学, 2015,35(9):2764-2771.

[31] 宋 伦,宋广军,王年斌,等.辽东湾浮游生物粒径结构稳定性分析[J]. 中国环境科学, 2015,35(10):3117-3126.

[32] Bruland K W, Orians K J, Cowen J P. Reactive trace metals in the stratified central North Pacific [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1994,58(15):3171-3182.

[33] 张玉凤,田 金,杨 爽,等.大连湾海域营养盐时空分布、结构特征及其生态响应 [J]. 中国环境科学, 2015,1:236-243.

[34] 李清雪,陶建华.应用浮游植物群落结构指数评价海域富营养化 [J]. 中国环境科学, 1999,19(6):548-551.

[35] 邓春梅,于志刚.东海、南黄海浮游植物粒级结构及环境影响因素分析 [J].中国海洋大学学报, 2008,38(5):791-798.

An evaluation of the risks from toxic algae and their relationships with environmental conditions in Liaodong Bay.

SONG Lun1,2, WU Jing2, LI Nan2, DU Jing2, WANG Kun2, LIU Gui-ying2, WANG Peng1*

(1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, School of Environment, Harbin Institute of Technology, Haerbin 150090, China；2.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China)., 2018,38(8)：3049~3059

Taking the V4region of 18S rDNA as the target gene, we designed the primer V4 (F/R) and adopted high-throughput sequencing technology to evaluate the diversity and relative abundance of the eukaryotic phytoplankton community in different seasons of the year 2014 in Liaodong Bay. The results showed that there were 29 toxic algae in Liaodong Bay, including 8kinds of paralytic shellfish poisoning (PSP) algae, 2kinds of diarrhetic shellfish poisoning (DSP) algae, 3kinds of yessotoxic (YTX) algae, 2kinds of neurotoxic shellfish poisoning (NSP) algae, 13kinds of hemolysin, and a kind of exopolysaccharide (EPS) algae. Of these, 19toxic algae were reported to have caused either red or brown tides. Eight of the toxic algae, most of which belonged to Dinophyta, were capable of causing large-scale fish deaths. We found 18algal species that had been previously undetected or unreported in Liaodong Bay, in which 9algal species even had not previously appeared in other Chinese waters. The algal species had different trophic modes, including 8kinds of autotrophs, 20kinds of mixotrophs, and a kind of heterotroph. There were high risks from PSP, YTX, and NSP in summer;high risks from NSP in autumn; high risks from DSP in spring and summer; and the eastern and western waters of Liaodong Bay were prone to shellfish toxicity disasters. During spring, the water temperature was significantly and negatively correlated with the biomass of YTX and NSP algae. During summer, some environmental factors, such as chemical oxygen demand, oil, dissolved inorganic nitrogen (DIN), lead, and cadmium, were significantly and positively correlated with toxin-producing algae, but zinc, arsenic, oil, and DIN were positively correlated with toxic algae in the winter. The environmental factors were not significantly correlated with toxic algae in the autumn. The correlations between toxic algae and environmental factors should be further explored.

toxic algae；shellfish poisoning；risk distribution；environmental correlation；Liaodong Bay

X171.1

A

1000-6923(2018)08-3049-11

宋 伦(1980-),男,辽宁大连人,副研究员,硕士,主要从事海洋生物生态学研究.发表论文60余篇.

2018-01-10

国家自然科学基金资助项目(51779066);辽宁省海洋与渔业科研项目(201710);大连市高层次人才创新支持计划-青年科技之星项目(2016RQ080)

* 责任作者, 教授, pwang73@vip.sina.com