探讨免疫组化检测脑胶质瘤IDH1及应用

王玉环

源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤，占颅脑肿瘤的40%～50%[1]，是最常见的颅内恶性肿瘤，年发病率为3～8人/10万人口[2]。脑胶质瘤在临床上具有发病率高、复发率高、死亡率高、治愈率低的特点[3]。目前，脑胶质瘤的治疗手段以手术切除为主，术后辅助以放疗、化疗等手段，预后不佳[4]。IDH1是三羧酸循环中重要的关键限速酶[5]，催化异柠檬酸氧化脱羧生成二氧化碳及α-酮戊二酸（α-KG），可为细胞新陈代谢提供能量和生物合成前体物质[6]。近年来，Parsons等[7]学者研究发现IDH1的异常表达与胶质瘤的发生密切相关，并且在胶质瘤的诊断、治疗、预后有重要意义。本文以胶质瘤作为研究样本，通过Ventana Bench Mark ULTRA 全自动免疫组化染色法及手工免疫组化SP染色法了解IDH1突变情况，探索IDH1突变与胶质瘤发展及其预后间的关系，为胶质瘤诊断与治疗提供理论依据，并为今后的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年1月—2018年4月厦门大学附属第一医院手术切除的13例经病理学诊断为胶质瘤的肿瘤标本组织。13例患者术前均未接受药物化疗、放射治疗等其他治疗，并且排除合并其他全身性疾病。组织病理标本由我科经验丰富的主治医师取材，然后经固定、脱水、石蜡、包埋（制成蜡块）、切片、染色并详细筛选、复核后明确诊断为胶质瘤。

1.2 试剂

即用型鼠抗人IDH1R132H单克隆抗体（克隆号：H09）， 购自福州迈新生科技术开发有限公司。ventana Bench Mark ULTRA全自动免疫组化仪上的试剂包括：DAB试剂盒（包含Ultra View Universal DAB inhibitor、Ultra View Universal HRP Multimer、Ultra View Universal DAB Chtomogen、Ultra View Universal DAB H2O2、Ultra ViewUniversal DAB Copper），脱蜡液（EzPrep），抗原修复液（CC1，pH8.5 Tris-EDTA），液体封盖膜（LCS），苏木精染液，靛蓝染色液，清洗缓冲液（Reaction Buffer），缓冲液（SSC），以上试剂均购自罗氏诊断产品（上海）有限公司。

1.3 实验方法

每例胶质瘤病例取一块带有肿瘤的蜡块，连续切片2张，切片厚约4 μm，黏贴于带阳性对照的防脱载玻片上，60℃烤片1 h。切片内正常脑组织表达阴性为内对照。分别采用ventana Bench Mark ULTRA全自动免疫组化仪（实验组）与手工免疫组化SP染色法（对照组）进行IDH1免疫组织化学检测。结果判断标准：IDH1阳性信号定位于细胞浆。

2 结果

2.1 实验组结果

染色强度强、着色均匀、阳性定位准确、背景清晰、干净、无非特异染、结果容易判读，见图1。结果显示IDHl表达阴性6例，阳性7例。

2.2 对照组结果

染色强度较弱、着色欠均匀、阳性定位不准确、背景不清晰、有非特异染色、结果判读受干扰，见图2。结果显示IDH1表达阴性6例，阳性7例。

3 讨论

IDHI是体内重要的氧化还原酶，是三羧酸循环的关键酶之一[8]。IDH1 突变后会催化α- 酮戊二酸还原为2- 羟基戊二酸，2-羟基戊二酸作为IDH 突变后生成的代谢废物[9]，一般在人体细胞中含量很低，如果大量存在，会直接抑制人体内组蛋白去甲基化酶与DNA 去甲基化酶等的多个重要双加氧酶的活力[10]，改变细胞的生长方式和增值，进而诱发肿瘤[11]。科学研究发现IDH1基因突变与胶质瘤的发生发展、预后有密切关系后，IDH1基因突变的检测成为了胶质瘤患者常规检查项目之一[12]。本实验所用的克隆号为H09的IDH1，可特异性地检测R132H类型的点突变。本研究表明：手工免疫组化SP染色法检测结果一致。

图1 实验组IDH1阳性（×40）

图2 对照组IDH1阳性（×40）

免疫组化染色法从手工操作发展到半自动免疫组化仪再到全自动免疫组化仪操作，节省了人力成本和时间。手工免疫组化SP染色影响因素很多，例如抗体修复程度的把握，一抗孵育时间和温度控制，且整个染色过程时间较长，一般需要4～24 h不等，如果大批量的操作，费时费力。而全自动免疫组化染色仪从脱蜡开始、孵育、抗原修复、抗体滴加、孵育、DAB显色完成整个过程都在线完成，通过软件准确控制所有试剂的孵育时间和温度，染色结果稳定。作者在同一张待测片上黏贴阳性对照片，阳性对照与待检测组织在同一张切片上进行染色，实现了实验条件的一致性，同时有阳性对照和阴性内对照，达到了免疫组化染色的标准化，增加了染色结果准确性。此外切片也可直接归档保存，不需要单独保存阳性对照切片，一举两得。作者通过对比实验，发现全自动免疫组化染色仪染色较手工法阳性表达定位准确、着色均匀、背景清晰、无非特异染色，并且操作简单、运行时间短，可以批量化操作大大节省了劳动力，提高了工作效率。机子所有的废液都回收，不直接排放，节能环保。

通过对IDH1 免疫组化染色结果的分析，作者发现突变只发生于肿瘤细胞自身，正常的血液细胞、内皮细胞等无染色。IDH1染色强度与肿瘤细胞级别无关。WHOⅡ级的弥漫性星形细胞瘤，WHOIII级的间变性星形细胞瘤，或者WHOIV级的胶质母细胞瘤，IDH1突变阳性的肿瘤细胞并没有随着肿瘤级别的进展而增加，不呈正相关的关系。

综上所述，全自动免疫组化染色仪染色较手工法阳性表达定位准确、着色均匀、背景清晰、无非特异染色，并且操作简单、运行时间短，可以批量化操作，大大节省了劳动力，提高了工作效率。推荐全自动免疫组化法作为临床检测IDH1基因突变的首选方法。