褪黑素-组织工程化细胞膜片-种植体复合物对骨质疏松动物骨结合影响的实验研究

梁宏润 秦浩 林云红 徐倩

种植义齿现已成为恢复患者缺牙功能的可靠治疗手段。骨结合作为种植义齿修复成功的金标准，是种植体承载各向负荷的物质基础。但骨质疏松缺牙患者对口腔的影响主要表现为颌骨骨量的丢失[1]，限制了种植义齿的应用[2]。近年来，随着国内外学者对褪黑素(melatonin，MT)研究的深入，发现与老年性骨质疏松存在一定联系。MT可通过多种途径[3-4]促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞活性，并促进骨基质的矿化成熟；同时对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stromal stem cells, BMSCs)的成骨向、成脂向分化起到重要的调节作用[5]。本研究拟通过构建骨质疏松大鼠模型，在其胫骨干骺端植入已制备好的褪黑素-骨髓间充质干细胞膜片-纯钛种植体复合物，观察褪黑素对骨质疏松动物模型骨结合的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物

2 月龄雌性SD大鼠，健康未孕，体重180～220 g，由昆明医科大学实验动物中心提供。

1.2 实验材料

褪黑素(Sigma，美国)；成骨诱导液(配制含10%FBS，Gibco，美国)；0.2 mmol/L抗坏血酸、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠(Biosharp生物科技公司，合肥)；纯钛种植体(Φ2 mm×5 mm，深圳名扬义齿加工厂)；电动立式单柱测试台(SJX，上海思为)；Micro-CT(ZKKS-MCT-Sharp-IV，广州中科恺盛医疗科技有限公司)；硬组织切片机(E300CP，EXAKT公司，德国)。

1.3 制备褪黑素-骨髓间充质干细胞膜片-纯钛种植体复合物

取大鼠骨髓原代培养BMSCs，至 P2时经流式细胞仪(FACS Calibur，BD，美国)鉴定，确认后将其诱导成膜，膜片形成后经脱细胞处理、干燥、消毒，接种 P1细胞于膜片上，并置换含褪黑素的成骨诱导液和不含褪黑素的成骨诱导液，培养10 d后将膜片包裹种植体，培养4 d后备用(图 1)。

图 1 褪黑素-骨髓间充质干细胞膜片-纯钛种植体复合物

1.4 建立骨质疏松大鼠模型和种植体植入

随机选取40 只大鼠分成去势组30 只和假手术组10 只，去势组完整切除大鼠双侧卵巢组织，假手术组仅切除大鼠卵巢周围等体积的脂肪组织。去势手术后8 周称重，每组随机抽取2 只大鼠处死，取其子宫及胫骨干骺端标本HE染色后组织学观察。确定建模成功后将去势组大鼠28 只，随机分为A、B组，各组14 只，在其左右侧胫骨干骺端植入实验用种植体，A组左侧胫骨记为空白对照组，植入经钝化处理的种植体，A组右侧和B组右侧胫骨分别记为阳性对照组1和阳性对照组2，植入经钝化处理的骨髓间充质干细胞膜片种植体复合物，B组左侧胫骨为实验组，植入经钝化处理的褪黑素-骨髓间充质干细胞膜片种植体复合物。

1.5 种植体骨结合评价

种植术后第4、8周，分批处死实验动物，每批每组随机抽取3 只大鼠，取带种植体的胫骨干骺端标本，经力学测试仪行种植体抗拔实验(图 2)，速度为2 mm/min。剩余大鼠取带种植体的骨组织标本进行Micro-CT扫描，选取距种植体表面2 mm的区域为感兴趣区域(region of interest, ROI)，对比观察去势组及假手术组大鼠种植体骨结合情况。扫描后的标本制作硬组织切片并行甲苯胺蓝染色，观察并计算种植体-骨结合率(bone-implant contact，BIC)。

图 2 拉力测试示意图

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 BMSCs表面抗原流式检测结果

BMSCs表面分子标记物显示CD29、CD90表达率分别为98.81%、 95.69%；CD45、CD34表达率分别为1.07%、4.40%(图 3)。证明所培养的细胞为间充质来源的干细胞。

体重测量去势后大鼠体重明显高于假手术组，且变化具有统计学意义(表 1)。

Tab 1 The weight of rats before and 8 weeks after ovariectomy (g，

注： ①组间比较,P=0.031<0.05

2.2 骨质疏松模型建立后组织学观察

术后8 周，OVX组大鼠子宫腔明显萎缩，腺体数量明显减少，腺腔多闭合，胫骨干骺端骨小梁出现断裂，骨小梁数目减少，变细、稀疏而不连续；SHAM组大鼠子宫腔大小正常，腺体发达，胫骨干骺端骨小梁排列规则，连续性好(图 4)。表明所建骨质疏松大鼠模型可靠。

图 3 BMSCs表面抗原流式鉴定

图 4 组织学观察 (HE, ×40)

Fig 4 Histomorphological observation (HE, ×40)

2.3 种植体植入后生物力学测试

结果显示，第4、8周时2 个阳性对照组植体拔出力值无差异，实验组力值大于阳性对照组和空白对照组，且实验组8 周时力值大于4 周时(表 2)。说明褪黑素可增加植体与骨之间的结合强度，且与植入时间呈正相关。

2.4 种植体植入后Micro-CT扫描结果

种植术后4、8 周，阳性对照组1和2植体周围新骨形成无明显差异，且多于空白对照组，少于实验组。实验组8 周时新骨形成较4周时明显增多(图 5)。骨形态计量学参数测定显示，阳性对照组1和2各参数之间无统计学差异，4 周时实验组骨小梁数量(Tb.N)、骨表面分数(BS/BV)、骨体积分数(BV/TV)明显高于阳性对照组和空白对照组植体(P<0.05)，8周时实验组骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨表面分数(BS/BV)、骨体积分数(BV/TV)明显高于阳性对照组和空白对照组(P<0.05)，而骨小梁间隔(Tb.Sp)与阳性对照组和空白对照组相比明显降低(P<0.05)。说明褪黑素可促进植体周围新骨形成，使骨小梁数目增多(表 3)。

2.5 种植体植入后组织学观察及BIC测定结果

种植术后4、8 周，阳性对照组1和2植体周围新生骨及类骨质无明显差异，且多于空白对照组，少于实验组。实验组8 周时新生骨及类骨质较4周时明显增多(图 6)。骨结合率(BIC)测定结果4 周时空白组为33%，阳性对照组1为47.67%，实验组为61.67%，阳性对照组2为46%，8 周时空白组为39.67%，阳性对照组1 为56.67%，实验组为71.67%，阳性对照组2为55%(图 7)。说明褪黑素可提高植体周围骨结合率并与植入时间成正相关。

时间(周)A组左侧(空白对照组)A组右侧(阳性对照组1)B组左侧(实验组)B组右侧(阳性对照组2)412.37±0.61①17.90±1.11②31.67±2.51①③19.57±1.30②818.23±1.24①28.13±2.14②47.30±2.10①③27.87±2.11②

注： ① 实验组与空白对照组和阳性对照组相比,P<0.05； ② 2 个阳性对照组相比,P>0.05； ③ 实验组8 周与4 周相比，P<0.05

图 5 Micro-CT扫描图

骨小梁参数时间(周)A组左侧(空白对照组)A组右侧(阳性对照组1)B组左侧(实验组)B组右侧(阳性对照组2) BV/TV(%)412.70±0.59①22.43±0.6645.05±1.47①22.54±0.60②822.29±0.82①40.83±0.8659.17±0.56①40.66±0.48②BS/BV(%)422.90±0.15①27.51±0.5131.05±1.13①27.57±0.43②830.14±0.24①42.94±0.2750.30±1.36①42.29±0.80②Tb.Th(mm)40.076±0.003①0.086±0.0020.107±0.013①0.089±0.002②80.087±0.003①0.176±0.0480.378±0.035①0.176±0.049②Tb.N(1/mm)41.561±0.139①3.602±0.1444.891±0.122①3.661±0.105②82.523±0.338①5.246±0.0806.780±0.107①5.439±0.276②Tb.Sp(mm)40.137±0.036①0.095±0.0050.067±0.003①0.086±0.006②80.101±0.006①0.070±0.0010.041±0.003①0.072±0.004②

注： BV/TV： 骨体积分数； BS/BV： 骨表面分数； Tb.Th： 骨小梁厚度； Tb.N： 骨小梁数量； Tb.Sp： 骨小梁间隔； ① 实验组与空白组和阳性对照组相比，P<0.05； ② 2 个阳性对照组相比，P>0.05

3 讨 论

种植义齿修复成功的主要标志之一是种植体与骨组织之间形成良好的骨结合，种植部位的骨量和骨质是影响种植体骨结合的重要因素。我国现已进入老龄化社会，骨质疏松症患者日益增多，骨质和骨量缺陷将影响骨组织对种植体的支持，延长愈合时间，从而影响种植体骨结合，容易造成种植体松动、脱落，甚至可能导致种植的失败[6-8]。因此，骨质疏松症是现在公认的牙种植修复的危险因素之一[9-10]，为了满足骨质疏松患者对种植牙的需求，提高骨质疏松患者种植义齿成功率具有重要的意义。

目前，对骨质疏松患者行牙种植治疗时，常辅助药物治疗或在种植手术时采用骨挤压等方法来改善种植体的骨密度。然而，骨挤压虽在一定程度上可增加局部骨密度，提高种植体初期稳定性，但也有学者指出，骨挤压的过程实际上是对骨孔周围骨小梁的破坏，对于骨质疏松缺牙患者，该技术对种植体的早期骨结合并没有促进作用，甚至可能有潜在的不良影响，其远期效果还有待于观察[11-12]。药物治疗包括雌激素、甲状旁腺激素等，但这些药物仍以抑制过分骨吸收为主，作用途径较单一、作用效果也有限，而且在疗效和安全性上，没有充足的依据表明哪种药物更好[13]。

图 6 甲苯胺蓝染色 (×100)

Fig 6 Toluidine blue staining (×100)

图 7 各组大鼠种植体骨结合率

褪黑素是一种普遍存在于多种生物体内的激素，主要是由哺乳动物和人类的松果体产生，具有促进睡眠、调节时差、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等多项生理功能。近年来发现褪黑素和老年性骨质疏松存在着某种联系，随着人年龄的增长，血清中的褪黑素水平有下降趋势，骨质疏松的发生几率逐渐增加且被证明与褪黑素下降有关[14]。年龄超过50 岁的人体内褪黑素的血清学水平显著低于青春发育期的人群[15]。骨代谢的变化决定着骨质疏松的发生、发展，在骨代谢方面，褪黑素可通过多种途径促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞活性，并促进骨基质的矿化成熟；同时对BMSCs的成骨向、成脂向分化也起到重要的调节作用。有研究指出，在兔的胫骨组织植入钛种植体之后，相较于没有添加褪黑素的对照组，添加褪黑素的植体周围新骨能够迅速的形成[16]，因此褪黑素促进成骨的作用已被证实。

本实验将褪黑素-组织工程化细胞膜片与种植体复合后植入骨质疏松大鼠体内，在生物力学、骨组织学和骨计量学指标上观察到，种植术后第4、8周，复合了褪黑素-组织工程化细胞膜片的种植体组骨结合强度显著高于没有复合褪黑素的细胞膜片种植体组及未复合膜片的种植体组；术后4 周和8 周时均可观察到复合了褪黑素-组织工程化细胞膜片的种植体周围新骨形成较多，骨密度，骨小梁数目、厚度及种植体骨结合率均显著高于没有复合褪黑素的细胞膜片种植体组和未复合膜片的种植体组；同时随着植入时间的延长，即8 周时复合了褪黑素的种植体周围的骨小梁数目和单位骨量与4 周时相比逐渐增加，种植体骨结合强度和骨结合率也有显著提高。正是利用了褪黑素对骨代谢的调节，促进成骨细胞增殖分化，抑制破骨细胞活性，促进骨基质矿化成熟，同时对BMSCs成骨诱导的作用，使其新骨形成增多，骨密度增高，促进骨愈合，进而使骨结合强度增高，骨结合率增大，且随植入时间的延长骨结合强度和骨结合率都相应增加。由于种植体周围骨质量的改善，提高了种植体骨结合率，从而为种植体提供良好的支持作用。褪黑素可加快骨形成速度、缩短骨改建的时间、促进骨组织矿化、加强周围骨组织的支持作用，改善骨质疏松状态对种植体骨结合的不利影响，从而有利于提高种植体的成功率。

褪黑素作为目前临床治疗骨质疏松的一种潜在药物，其作用机制与成骨效果会越来越受到临床医生与科研人员的关注和重视。而其在骨质疏松状态下行种植修复时的应用，对于加速种植术后的种植体早期骨整合，增加种植体的骨结合强度及改善种植体周围骨质量，提高骨质疏松患者的种植成功率等，有着极为重要的意义。本实验将褪黑素这种潜在的抗骨质疏松药，利用组织工程的方法来承载，并将其局部应用于骨质疏松种植领域，具有一定的创新性，为将褪黑素应用于骨质疏松缺牙患者，提高其种植成功率提供科学合理的实验依据和理论支持，但实验中所用植体并非现有种植系统中的任何一种，因此后期可以设计结合某个种植系统的植体进行相关实验，并探讨更多褪黑素局部应用于种植体骨结合的方法。

4 结 论

褪黑素-组织工程化细胞膜片-种植体复合物能增加骨质疏松大鼠植体周围骨密度，改善骨结构，增强种植体与骨组织结合的强度，使种植体周围新生骨和类骨质增多，种植体骨结合率增加，促进骨改建，从而提高种植体骨结合的质量，且种植体骨结合强度和骨结合率均随植入时间延长不断提高。