吡咯喹啉醌在抗腮腺辐射损伤的保护作用研究

黄元清 苗登顺 陈宁

放射治疗是头颈部恶性肿瘤综合治疗中有效方法之一，但腮腺辐射损伤引起口腔干燥是头颈部放射治疗的主要和常见并发症之一[1]，严重影响患者的生活质量。Wang等[2]证实小鼠非致死性剂量的全身辐射(total body irradiation, TBI)能诱导造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)中活性氧类(reactive oxygen species, ROS)水平的升高，导致HSCs成熟前早衰。因此放射防护的关键是抑制氧化应激清除过多的ROS防止DNA 损伤。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)首次在甲基营养菌中被鉴定为一种乙醇和葡萄糖脱氢酶的新型辅因子，目前被认为是一种重要的营养生长因子[3]。研究发现PQQ的化学结构为一种4,5-二羟基-4,5-二氧喹啉-2,7,9-三羧酸复合物[4]，被认为是细菌葡萄糖脱氢酶氧化还原的辅因子，广泛分布于植物、细菌、动物、食物以及许多生物体液内[5]，具有水溶性和热稳定性等特点。

前期研究已经证实[6]，PQQ作为抗氧化剂能部分纠正Bmi-1缺失诱导的颌骨和牙齿骨质疏松。表明PQQ可能通过清除氧自由基ROS，从而延缓机体骨质疏松。因此我们推测PQQ是否能够通过抑制氧化应激，降低ROS水平保护线粒体功能，从而对TBI引起小鼠腮腺损伤具有保护作用？

本研究利用TBI引起小鼠腮腺损伤的动物模型，推测PQQ是否能够通过抑制氧化应激，降低ROS水平，从而发挥对腮腺辐射损伤的保护作用。

1 材料与方法

本项研究经过了南京医科大学动物实验伦理委员会的批准(批准号： BK2006576)。

1.1 实验动物

1.1.1 实验动物 C57BL/6J小鼠(8 周龄)购买于南京大学动物实验中心。小鼠饲养在南京医科大学SPF级动物实验中心，所有试验程序均按照美国国立健康与伦理道德委员会以及关爱动物实验中心的要求来进行。

1.1.2 实验动物分组 将30 只雌性C57BL/6J 小鼠分成3 组，每组10 只将分别给予以下不同处理：对照组为普通饮食(含1%钙、0.67%磷)饲养未经TBI处理；TBI组为4 Gy TBI加普通饮食(含1%钙、0.67%磷)饲养；PQQ治疗组为4 Gy TBI+4 mg PQQ/kg普通饲料的小鼠作为实验组。

1.1.3 小鼠接受TBI的条件 小鼠置于有机玻璃盒内，加盖有孔，固定小鼠，背上腹下，通过直线加速器(Varian 600CD，Faxitron Contact公司，德国)从盖上小孔行单剂量全身辐射，辐射时间为10 min，辐射剂量参照Dirix等研究[7]以4 Gy剂量行小鼠TBI可导致腮腺细胞损伤。

1.1.4 PQQ饮食补充剂量为4 mg PQQ/kg普通饲料，依据参照课题组前期研究[6]PQQ对小鼠颌骨和牙齿骨质疏松影响的研究。

1.2 实验方法

1.2.1 取材 经TBI后4 周，取3 组小鼠，断颈处死。取右侧腮腺使用能更好保存酶活性和组织抗原性的PLP(2%副醛，75 mol/L赖氨酸，10 mol/L过碘酸钠) 固定液固定，经常规脱水、石蜡包埋、切片，用于HE染色、组织化学染色和免疫组化染色；取左侧腮腺提取蛋白质用于Western blot分析；另取一组的同侧腮腺进行流式细胞仪(BD Biosciences FACSCanto II,Becton, Dickinson and Co，美国)检测ROS水平。

1.2.2 HE染色 石蜡切片常规脱蜡水化，苏木精(Sigma，美国)染色，1%盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝，伊红(Sigma，美国)复染，常规脱水透明，中性树胶封片。

1.2.3 免疫组织化学染色 取腮腺组织的石蜡切片进行固定、脱水、石蜡包埋切片，进行增殖细胞核抗原(PCNA)、8-hydroxy-2’-deoxyguanosine(8-OH-dG)免疫组织化学染色以及TUNEL染色。

1.2.4 Western blot 取左侧腮腺组织提取的蛋白质，作Western blot分析，观察细胞衰老相关蛋白表达的变化，检测指标如下：SOD1、SOD2、P16、P19表达的变化。

1.2.5 流式细胞仪ROS水平检测 用0.25%胰酶消化腮腺组织块，制备单细胞悬液，加入ROS敏感的荧光探针2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酯(DCF-DA)，流式仪检测细胞内荧光探针平均荧光强度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0软件对腮腺组织的计量资料3 组间的总体比较和两两比较分别进行单因素方差分析和t检验，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。采用Image Pro Plus图像处理与分析软件分析组化染色图像。

2 结 果

2.1 PQQ对TBI诱导的腮腺形态损伤的作用

与正常小鼠腮腺HE染色比较观察发现：10 只经4 Gy TBI后第30天小鼠腮腺腺泡细胞排列出现紊乱，腺泡细胞萎缩、消失、导管扩张，可见脂肪空泡变性。而与4 Gy TBI组相比较，4 Gy TBI+PQQ组(图 1)小鼠腮腺腺泡细胞增多，排列较规则，间质中脂肪空泡性变改善。这些数据表明PQQ对TBI诱导的C57BL/6J小鼠腮腺形态损伤具有纠正作用。

图 1 PQQ对TBI诱导的腮腺损伤形态学的作用 (HE, ×400)

Fig 1 The effects of PQQ on the morphology of parotid glands induced by TBI (HE, ×400)

2.2 PQQ对TBI诱导小鼠腮腺间质纤维化的作用

Masson染色结果发现：4 Gy辐射组小鼠腮腺纤维化程度明显高于未辐射组，然而，饮食补充PQQ明显减少了间质纤维化面积(图 2)，这些数据表明PQQ减少TBI小鼠腮腺间质纤维化的作用。

2.3 PQQ对TBI小鼠腮腺细胞增殖的影响

代表增殖细胞标志物PCNA的免疫组化学染色结果发现：TBI小鼠腮腺间质PCNA阳性细胞百分比明显较未被辐射组小鼠减少。而PQQ具有明显增加TBI小鼠腮腺间质PCNA阳性细胞百分比的作用(图 3)。表明PQQ具有促进TBI小鼠腮腺细胞增殖的作用。

图 2 PQQ 对小鼠腮腺间质纤维化的作用 (Masson染色, ×200)

Fig 2 The effects of PQQ on the stromal fibrosis of parotid glands (Masson staining, ×200)

图 3 PQQ 对损伤腮腺细胞增殖的影响 (×400)

Fig 3 The effects of PQQ on the cell proliferation of damage parotid glands (×400)

2.4 PQQ对TBI小鼠腮腺细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果发现TBI小鼠腮腺中表示凋亡的细胞TUNEL阳性细胞百分比明显较未被辐射组小鼠增加。而PQQ具有明显减少TBI小鼠腮腺细胞TUNAL阳性细胞百分比的作用(图 4)。表明PQQ具有减少TBI小鼠腮腺细胞凋亡的作用。

图 4 PQQ 对受损腮腺细胞凋亡的影响 (TUNEL 染色， ×400)

Fig 4 The effects of PQQ on the cell apoptosis of impaired parotid glands (TUNEL staining， ×400)

2.5 PQQ对TBI小鼠腮腺DNA损伤的影响

代表DNA损伤标志物8-OH-dG免疫组织化学染色结果发现：TBI小鼠腮腺细胞8-OH-dG阳性百分比明显较未被辐射组小鼠增加。而PQQ具有明显减少TBI小鼠腮腺细胞8-OH-dG阳性细胞百分比的作用(图 5)。以上数据表明PQQ具有减少TBI小鼠腮腺细胞DNA损伤的作用。

2.6 Western blot

结果发现PQQ具有上调各种抗氧化蛋白的作用。且具有抑制各种细胞周期依赖性激酶抑制剂的作用(图 6)，从而调节细胞周期，促进细胞增殖发挥对TBI小鼠腮腺损伤的保护作用。

图 5 PQQ 对TBI诱导腮腺DNA损伤的修复作用 (×400)

Fig 5 The effects of PQQ on the DNA damage of parotid glands induced by TBI (×400)

图 6 PQQ对辐射后腮腺抗氧化蛋白、细胞周期蛋白的调节作用

2.7 PQQ对受损腮腺组织ROS 水平的调节作用

为了验证PQQ是否通过抑制氧化应激，降低ROS水平，从而对TBI小鼠腮腺起损伤保护作用，取小鼠腮腺进行流式细胞ROS的检测，结果发现：TBI小鼠腮腺组织ROS 水平明显较未被辐射组升高，而饮食补充PQQ确实具有降低ROS水平的作用(图 7)。

图 7 PQQ 对辐射后腮腺组织ROS水平的调节作用

3 讨 论

动物实验已经证明[8]，X-射线辐射能减少天然抗氧化剂维生素E的产生。在本研究中，我们利用全身辐射导致小鼠腮腺损伤动物模型，验证PQQ作为抗氧化剂是否具有防止腮腺损伤的作用。结果证明饮食补充PQQ治疗经TBI 后的C57BL/6J小鼠可明显减少腮腺损伤。

研究表明，经TBI小鼠24 h内腮腺早期受损表现为唾液量减少以及腮腺重量减轻[9]。然而，在临床上目前仍未找到一种合适药物来治疗辐射引起的腮腺损伤，因而研究者开始关注一种抑制或减少DNA损伤的辐射保护剂。这种辐射保护剂直接靶向减少电离辐射和活体组织中的氧自由基的形成[10]。作为一种强抗氧化剂，PQQ 可能具有清除氧自由基防止辐射引起腮腺分泌细胞损伤的作用[11-12]。

本研究发现饮食补充PQQ确实对受损腮腺具有保护作用。主要表现在：PQQ通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和DNA损伤纠正了受损腮腺的形态结构，然而PQQ发挥作用的分子机制目前尚未清楚；进一步的研究表明PQQ不仅抑制细胞周期依赖性激酶抑制剂和凋亡基因，而且上调不同抗氧化蛋白；同时也证明了PQQ能减少受损腮腺的ROS 水平。总之，PQQ 作为抗氧化剂能够抑制氧化应激减少ROS水平，同时通过下调p19, p16-Rb信号通路延缓细胞衰老。因而PQQ 对受损腮腺组织具有保护作用。

综合以上实验结果表明，PQQ对全身辐射诱导的C57BL/6J小鼠腮腺损伤具有保护作用；并进一步阐明PQQ可能通过上调抗氧化能力、抑制氧化应激、减少ROS水平参与DNA损伤修复作用，从而发挥对受损腮腺的辐射保护作用。为PQQ在辐射保护临床新药的研发提供一定的实验和理论依据。