高田村长寿老人肠道菌群中的抗氧化乳酸菌分离鉴定及评价

蔚晓敏 ，武晓丽 ，杨 栋 ，裘 梁 ，，吴姚平，王登远，魏 华，徐 锋*

（1.南昌大学 中德联合研究院，江西 南昌330047；2.江西中医学院基础医学部，江西 南昌330004）

近3年，SCIENCE和NATURE等高水平杂志发表了一系列文章，科学家们提出，肠道菌群可作为一个虚拟器官[1]，影响着人体的发育生长、营养与健康，甚至其与代谢性疾病（肠易激综合症[2]、炎症性肠病[3]、心血管疾病[4-5]、糖尿病[6]、肥胖[7]等）密切相关，阐述并证明了肠道菌群与人体健康乃至长寿的关联性。

湖南省浏阳市高田村地理位置相对封闭，其村民不仅长寿，而且普遍没有慢性疾病。与此形成鲜明对比的是，周边地区既无长寿现象，而且心血管疾病、慢性肠胃炎和癌症等疾病时有发生。但是有关该地区老人长寿原因，还未见任何报道，缺乏系统的研究。因为该村的居民与周边地区一直保持着婚配，故推测这里的长寿现象可能与遗传因素联系不紧密。Gierman等[8]通过完成了17例高加索地区百岁老人的全基因组测序，证明基因影响较小，而环境因素可能对长寿影响较大。肠道菌群受饮食、作息习惯，以及气候等[9-11]外界因素影响，导致不同人群之间差异很大，进而影响了人体的健康与长寿。

乳酸菌可调节机体胃肠道菌群平衡，提高机体免疫力，降低血清胆固醇，降血压，抗氧化抑制肿瘤发生等方面的特殊生理活性。长双歧杆菌BBMN68[12]分离自广西巴马长寿老人粪便，其活菌液对便秘模型小鼠有润肠通便作用，提高免疫力。唾液乳杆菌FDB86[13]可以缓解二甲肼对肠道菌群的不良影响，使肠道菌群趋近于正常状态，对结肠癌大鼠肠道菌群变化的调节作用。另外生物氧化是机体新陈代谢的重要生理过程，但此过程中会产生多种自由基，自由基的累积，会造成体内氧化损伤逐渐增多，导致老年慢性病发生，而清除过多的自由基可以延缓衰老[14]。

故此本文作者希望通过解析并分离高田村老人肠道菌群的特有菌株，从中筛选出抗氧化能力强的菌株，以期为今后探究长寿机制，预防老年慢性病，开发新型微生物制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

MRS培养基，DPPH，邻二氮菲，硫酸亚铁，PBS缓冲液，蛋白胨，牛胆盐,北京索莱宝科技有限公司产品；30%H2O2，西陇科学产品；无水乙醇，天津市大茂化学试剂厂产品;胃蛋白酶，胰蛋白酶，上海源叶生物科技有限公司产品。

1.2 主要仪器

显微镜，日本奥林巴斯公司产品；恒温培养箱，美国Queue公司产品；离心机，长沙维尔康湘鹰公司产品；厌氧培养箱，PLAS-LABS公司产品；全自动高压灭菌锅，中国上海博讯公司产品；超净工作台，苏州净化有限公司产品；紫外可见光分光光度计，Genesys 10s公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 粪便样品来源及采集，保藏 取采样前3个月未服用药物的21名高田村健康长寿老人的粪便。将晨起第一次新鲜的粪便5～10 g于无菌的离心管中，并立刻置于干冰中，一部分用于提取细菌DNA后，由北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行16S rDNA高通量测序，另一部分进行菌株分离筛选。

对该地区居民粪便进行分组，其中LLG1是该地区90岁以上的老人，平均年龄为93岁，样本量N=3；LLG2为80～89岁老人，平均年龄为84.4岁，样本量N=5；LLG3组为一长寿家族中的父母及其儿女组成，其中年龄最大的为父亲91岁，最小的儿子50岁，平均年龄69岁；LLG4年龄范围是70～79，平均年龄为 72岁，N=4；LLG5年龄区间为 60～69岁，平均年龄63.5岁，N=4。每组样本为相应该组成员粪便样等量混合均匀后提取DNA进行测序比较分析。

1.3.2 菌株分离方法 根据测序的结果，选择乳酸菌作为分离的目标菌。分别取1 g粪便溶于10 mL 10%蛋白胨溶液中，充分溶解，滤纸滤去残渣，滤液

用5 000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集沉淀，用1 mL 10%蛋白胨水重悬。按1%接种体积分数到MRS液体培养基中，过夜培养。培养液采用10倍梯度稀释， 梯度稀释为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和 10-9，每个梯度取 1 mL 分别均匀涂布于MRS固体培养基，37℃，厌氧培养48 h。从每份粪便样品中，挑取10株菌落形态不同的菌株，进行纯培养。将培养过夜的新鲜菌液用15%的脱脂乳保菌，于-70℃冰箱保藏菌株。

1.3.3 菌株氧胁迫筛选 将新鲜培养的菌株以1%的体积比接种到含0.4 mmol/L H2O2的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养8 h，分别测定0 h与8 h的OD630，检测菌株对H2O2的耐受性。选择在此条件下生长状况良好的菌株进行后续实验。用OD值差来表示菌株对H2O2的耐受性，即 ΔOD=OD6308h-OD6300h[15]。

1.3.4 菌株的鉴定 综合评价性能良好的菌株进行液体扩大培养，以27F/1492R为引物进行16S rDNA序列扩增，鉴定菌株的种属。将扩增产物进行测序。以待测菌基因组为模板进行PCR扩增，体系配置：Taq mix 10 μL，引物 1 μL，ddH2O 9 μL，总体积20 μL。扩增条件：预变性，95℃ 5 min，95℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环， 终延伸 72 ℃，10 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测扩增的目的条带。扩增产物经上海生物工程有限公司进行测序，得到的数据在NCBI数据库中已知菌株的16S序列BLAST比较相似性，初步判断菌株的种属。

1.3.5 菌株对模拟胃液的耐受性评价 模拟胃液：将磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 2.2）中添加胃蛋白酶使终质量浓度为3 mg/mL，现用现配。将对H2O2耐受性高的菌株的新鲜培养菌液，5 000 r/min离心10 min，菌体洗涤2次后重悬于模拟胃液中，保持菌浓度相同，37℃厌氧孵育30 min。在0 min和30 min分别用MRS固体培养基活菌计数[16]。

1.3.6 菌株对模拟肠液的耐受性的评价 模拟肠液：将PBS缓冲液pH调节为8.0，并添加体积分数0.45%胆盐，终质量浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶，现用现配。将对H2O2耐受性高的菌株的新鲜培养液，5 000 rmp离心10 min，菌体洗涤两次后重悬于模拟肠液中，保持菌浓度相同，37℃共孵育2 h。0 h和2 h分别用MRS固体培养基活菌计数[17]。

1.3.7 清除自由基能力的评价 按照接种量为1%接入MRS培养基中，厌氧37℃培养18 h，6 000 r/min离心10 min，分别收集发酵上清液和菌体。菌体用PBS（pH 7.2）溶液洗涤2次，再用PBS溶液重悬至乳酸菌数为109cfu/mL。发酵上清和重悬的菌体作为清除自由基试验的样品。

DPPH自由基的清除试验，参考的方法[18]：2 mL样品中加入2 mL DPPH无水乙醇溶液（0.2 mmol/L）混合均匀，室温避光反应30 min，6 000 r/min离心10 min，取上清液于517 nm处测定吸光度值Ai；空白组以等体积无水乙醇代替DPPH无水乙醇溶液Ao，对照组以等体积空白溶剂代替样品溶液Aj，并以等体积蒸馏水和乙醇混合液空白调零。

羟自由基清除试验，参照的方法[19]：0.5 mL的邻二氮菲（6 mmol/L），0.5 mL 的 FeSO4溶液（6 mmol/L）与1.0 mL的PBS溶液（pH7.2）混匀。再向此体系中加入0.5 mL样品和0.5 mL 0.1%过氧化氢，用双蒸水将总体积定容至4.0 mL。混匀后在37℃下孵育1 h，于536 nm下读取吸光度。羟自由基的清除率按下式（2）计算：

式 （2）中，As为样品的吸光度值；Ao为H2O替代样品；A为H2O替代H2O2和样品

2 结果与分析

2.1 高通量测序结果

采用Illumina MiSeq测序平台，对粪便微生物群落的16S rRNA的V4高变区进行测序，根据物种注释，统计每个样品在各分类水平（Kingdom，Phylum，Class，Order，Family，Genus，Species） （ 界 、门、纲、目、科、属和种）上的序列数目，物种序列构成柱状图见图1。LLG4在各个水平上均高于其他组。从图1可以看出，不同年龄段的物种的序列数不同，在种的水平上，LLG1高于其他组。在OTUs构建过程中，对不同样品的Effective Tags数据，低频数的Tags数据和Tags注释数据等信息进行初步统计，统计结果如图2，样品tag平均有25 759，平均OTU为955.6。不同样品之间OTU对比的维恩图，如图3 所示，LLG1，LLG2，LLG3，LLG4，LLG5 共有345个OTU，其中一部分为乳酸菌。鉴于乳酸菌是比较认可的安全菌株，故使用MRS选择性培养基从该地区健康长寿老人粪便中筛选特有的乳酸菌，为开发新型微生物制剂奠定工作基础。

图1 每个样品在各分类水平上的序列构成柱形图Fig.1 Each sample in the sequence of each classification level a bar chart

图2 不同样品的Tags和OTUs数目统计Fig.2 Statistics number of Tags and OTUs of samples

图3 各组样品之间比较的维恩图Fig.3 VEEN graph of compared with different samples

2.2 菌株对H2O2耐受性

各菌株对H2O2的耐受性表示不同，表1中菌株对0.4 mmol/L H2O2有较好的耐受性，受试菌株中L0105，L0302，L0608，L0902，L1001，L1014，LP1，LP2，LP3，LP4，LP5，LP6 对 0.4 mmol/L 有较高的耐受性，ΔOD＞0.9。其他的菌株基本不能生长，故不列于表中。

表1 分离菌株对H2O2的耐受性Table 1 Test of H2O2resistant

2.3 菌株的鉴定

为确定耐H2O2菌株的种属，进行16S rDNA序列测定，提取各菌株的总DNA进行PCR扩增，得到约1 500 kb的DNA片段测序后，将测定序列在NCBI数据库中进行序列同源性比对，根据比对结果确定菌株种属，具体结果见表2。其中，有5株发酵乳杆菌，2株植物乳杆菌，2株唾液乳杆菌，2株肠球菌，1株粘膜乳杆菌。

表2 菌株比对结果Table 2 Results of strains blast

2.4 对模拟胃液的耐受性

菌株在模拟胃液中孵育30 min后，菌株对胃液的耐受能力各不相同，如图4所示。其中0105、0302、1014和P3的菌液浓度可以保持在108cfu/mL，降低一个数量级，而0608、P2和P6在模拟胃液中孵育后，菌液浓度降低最多，存活率约为1%。说明胃蛋白酶和低pH对菌株有较大的影响。益生菌在使用过程中，先暴露在胃环境中，而胃蛋白酶和低pH对菌株有较大影响，可对其进行保护，如微囊化、与牛乳等共同服用，缓解胃液对菌株的损伤，扩大菌株的使用范围。

图4 耐H2O2菌株对模拟胃液的耐受性Fig.4 H2O2-resistant strains of resistance to simulated gastric juice

2.5 菌株对模拟肠液的耐受性

除P1，P2和P3，在模拟肠液中降低一个数量级外，其他菌株对模拟肠液均表现出较好的耐受性，2 h后，活菌浓度仍大于108cfu/mL，其中1014的耐受性最高，如图5所示。与模拟胃液相比，模拟肠液对部分菌株的存活影响较小，说明胰蛋白酶和胆盐对分离到菌株的存活影响较小，菌株能够在模拟肠液中存活。可能是菌株分离自肠道，对肠液的适应能力较强，而菌株没有经过胃液的作用，模拟胃液对其存活率影响较大。可见菌株的来源直接影响着菌株对模拟胃液，模拟肠液的耐受性。

图5 耐H2O2菌株对模拟肠液的耐受性Fig.5 H2O2-resistant strains of simulated intestinal resistance

2.6 清除自由基

1014对模拟胃液和模拟肠液的均表现出较好的耐受性，因此进一步评价其清除自由基的能力。由图6可知，发酵乳杆菌1014的发酵上清液对DPPH、OH-自由基的清除率分别为 63.28%、71.59%，均高于菌株的清除率。Li[19]报道，植物乳杆菌C88对DPPH的清除率为53.05%，Das[15]报道，植物乳杆菌DM5清除羟基自由基为48%，发酵乳杆菌1014对自由基的清除能力较好。DPPH是很稳定的自由基，菌体有较高的清除率表明受试菌株具有降低过氧化氢、过氧化自由基或脂质自由基连锁反应的能力，而羟自由基是活泼型最强，氧化能力最大的自由基，是引起机体氧化作用的重要因素，清除羟自由基可有助于维持细胞膜的完整性，延缓细胞衰老。

图6 发酵乳杆菌1014清除自由基的能力Fig.6 Ability scavenging of free radical on L.fermentum 1014

3 结 语

本研究以16S rDNA高通量测序为依据，分离筛选高田村居民肠道中共有的具有益生功能的乳酸杆菌。共分离到12株对H2O2耐受性较高的菌株，分别为5株发酵乳杆菌，2株植物乳杆菌，2株唾液乳杆菌，2株肠球菌，1株粘膜乳杆菌。对12株菌进行模拟胃液和肠液的耐受性进行测定，发现发酵乳杆菌1014具有较高的耐受性。进一步评价1014的不同组分对自由基的清除能力，结果表明1014的发酵上清液发挥了主要清除自由基的能力，对DPPH，OH-自由基的清除率分别为 63.28%，71.59%，而菌体的清除自由基能力相对较弱。因此后期将在本研究的基础上进一步针对发酵乳杆菌1014体内抗氧化研究同时研究其抗氧化物质及抗氧化的分子调控机制。