高产GSH果酒酵母的筛选及对苹果酒褐变的抑制

徐菁苒 ，毛 健 *， 刘双平 ，周志磊

(1.粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江南大学，江苏 无锡 214122；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

苹果酒是用苹果汁发酵制得的一种营养丰富、低酒精度的发酵制品，是仅次于葡萄酒的第二大果酒。苹果酒富含氨基酸、维生素、矿物质以及钙、铁、磷、钾等成分，不仅口感醇厚，酒香协调，且具有一定保健功效[1]。褐变是苹果酒生产与贮存过程中的一个重要问题，既影响酒体色泽、酒质和风味，又会造成一些营养物质的损失[2-3]。褐变的实质是苹果及苹果酒中的多酚物质发生氧化，在生产过程中，既存在酶促褐变又有非酶促褐变[4-5]。目前，抑制果酒褐变主要有物理、化学2种方法，其中在酿造及贮存过程中普遍应用的一种化学添加剂就是SO2，SO2虽具有很好的抗氧化性，但大量研究结果表明，它对人体健康会产生很大的危害[6-7]。随着社会发展，健康观念已越来越深入人心，人们对化学合成抑制剂的安全疑虑日益增加[8]，为此，找到替代SO2的天然抗氧化物质，并利用生物方法达到抑制褐变的效果，已经成为果酒行业的研究热点。

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合形成的三肽化合物，具有抗氧化、清除自由基、解毒等生理功能[9-10]。目前，利用微生物的物质代谢进行GSH生物合成已得到广泛的应用，发酵法生产GSH所用的菌种以酿酒酵母最为常见，主要通过γ-谷氨酰循环进行代谢[11]。因此，具有高GSH合成能力的菌株是提高GSH合成效率的关键。研究表明，GSH具有抑制果酒褐变的功效，表现出较强的抗氧化性[12]。而作为酵母菌的代谢产物，在不引入外源物质的前提下，通过筛选一株高产GSH的果酒酵母，利用微生物代谢抑制苹果酒在发酵过程中的多酚褐变，从而减少SO2等抗氧化剂的使用。

本文中探究了GSH对多酚褐变的抑制效应，并以14株果酒酵母作为实验材料，筛选出一株高产GSH的酵母菌株Y-18，该菌株能在降低果酒褐变值的同时保持较好的发酵特性。此研究利用生物方法减少褐变对果酒品质的影响，为高品质果酒的开发提供参考，在提高果酒安全性的前提下降低成本，具有广阔的研究前景。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料 新鲜富士苹果，购自市场，4℃保藏，使用前在25℃室温放置2 h。

1.1.2 酵母菌株 01号（31814菌株）、02号（31906菌株）、03号（31693菌株），购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；04#号 （2.2076菌株）、05#号（2.3848 菌株）、06# 号（2.2084 菌株）、07# 号（2.3851菌株），购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；Y1401、Y1402、Y1403、Y-18、Y-RW、Y-SY、Y 菌株，实验室保藏菌株，14株酵母菌均为酿酒酵母属（Saccharomyces cerevisiae）。

1.1.3 主要试剂 葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、无水乙醇、柠檬酸、三氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、乙酸钠、磷酸、抗坏血酸、亚硫酸钠购自国药集团；5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）、L-半胱氨酸、谷胱甘肽，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.4 主要仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪，沃特世（Waters）科技有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂制造；榨汁机，苏泊尔股份有限公司产品；恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司产品；恒温摇床，上海合恒仪器设备有限公司产品；7230G可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司产品；HG101-2电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司产品；冷冻离心机，德国eppendorf公司产品；FA2004N电子分析天平，梅特勒-托利多爱仪器（上海）有限公司产品；HH-S2系列恒温水浴锅，上海百典仪器设备有限公司产品；KQ-700E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；85-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司产品。

1.2 培养基

1.2.1 YPD固体培养基 酵母粉10 g/L，鱼粉蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 20 g/L；pH自然，0.1 MPa灭菌15 min。

1.2.2 YPD液体培养基 酵母粉10 g/L，鱼粉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；pH自然，0.1MPa灭菌15min。

1.2.3 摇瓶培养基 葡萄糖30 g/L，酵母粉10 g/L，硫酸铵6 g/L，磷酸氢二钾3 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.1 g/L；0.1 MPa灭菌15 min。

1.2.4 苹果汁活化培养基 调节苹果汁糖度为20°Brix，用柠檬酸调整培养基pH 3.5，酵母菌接种体积分数为5%，在25℃下发酵培养24 h。

1.2.5 苹果汁发酵培养基 调节鲜榨苹果汁糖度为20°Brix，调整培养基pH 3.5，酵母菌按体积分数5%的接种量接入苹果汁，在25℃下发酵。

1.3 实验方法

1.3.1 GSH对鲜榨苹果汁褐变的抑制效果 新鲜苹果，经自来水清洗、去核、切块、榨汁、离心、过滤后，分别加入抗氧化剂GSH、抗坏血酸（VC）、L-半胱氨酸（L-cys）、二氧化硫（SO2），浓度分别为 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L。以空白为对照，立即测定试样品在420 nm下的光密度值（OD值）；其余样品倒在培养皿，敞口放置在室温下以便充分氧化褐变，24 h后测定各试样OD420值。褐变值的变化率表示不同抗氧化剂对鲜榨苹果汁褐变的抑制效果，每个试样3次重复，取平均值。

式中，A0为 0 h OD420值；A1为 24 h 后 OD420值；A2为△OD420值；I为△OD420变化率。

1.3.2 果酒酵母发酵力测定 挑取酵母菌斜面种子一环接种于YPD液体培养基中，30℃摇瓶振荡培养24 h，作为种子液。将种子液按10%接种体积分数接种到YPD液态发酵培养基中，在25℃静态发酵，每隔24 h称一次质量，计算各株酵母菌发酵时产生CO2的质量。

1.3.3 果酒酵母耐受性测定 分别以不同乙醇和pH值作为酵母菌生长和发酵的影响因素，通过测定发酵24 h后发酵液的OD600值，比较14株酿酒酵母在不同影响因素中的耐受性[13]。

1.3.4 果酒酵母产GSH能力测定 将种子液以10%的接种体积分数接种于pH 3.5和pH 6.5的摇瓶培养基中，在30℃、150r/min摇床中振荡培养48h，测定生物量、酵母发酵液及胞内GSH的质量浓度。

1.3.5 果酒酵母发酵性能测定

1）果汁培养基调配

分别用蔗糖和1 mol/L的苹果酸调节果汁糖度为 20°Brix，pH 值为 3.5。

2）苹果酒发酵

取500 mL的三角瓶，加入400 mL苹果汁，按5%的接种体积分数接入酵母种子液，在25℃下恒温发酵，发酵初期微晃瓶体，使附着在瓶壁的酵母脱落，在发酵过程中每天取样测定理化指标，当渣完全沉淀且无气泡产生时则认为发酵结束。

1.4 测定方法

1.4.1 HPLC法测定发酵液中GSH质量浓度

1）色谱条件：色谱柱：Athena C18-WP，流动相为0.05 mol/L pH 5.6醋酸钠缓冲液和甲醇（V/V=90∶10），流速为 1.0 mL/min，紫外检测波长 330 nm，进样量 20 μL，柱温 40.0 ℃[14]。

2）样品处理：取1 mL样品，加入1 mL 10%三氯乙酸，在转速10 000 r/min下离心8 min，沉淀蛋白质。取1 mL上清液，加入0.5 mL 500 μmol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液，混合均匀，加入20 μL纯水，再加入0.5 mL 0.01 mol/L DTNB，振荡均匀，室温反应5 min，再加入0.1 mL 7.0 mol/L磷酸溶液酸化，10 000 r/min离心8 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜后进行HPLC分析[14]。

1.4.2 菌体生物量测定 将25 mL菌体培养液倒于已知重量的干净离心管中，在转速8 000 r/min离心10 min后弃去上清液，并加入适量蒸馏水洗涤2次，置于干燥箱中在105℃下烘干至恒重，总质量与离心管质量量之差即菌体干重，由此计算培养液的菌体生物量。

1.4.3 胞内GSH质量浓度测定 取10 mL发酵液，在转速8 000 r/min离心10 min后弃去上清液，收集菌体。加入适量蒸馏水洗涤2次后，加入10 mL 40%乙醇溶液，振荡器混合均匀，室温下抽提2 h，在转速8 000 r/min离心10 min得上清液，稀释后进行HPLC测定[15]。

1.4.4 发酵液色度的测定 取果汁或果酒发酵液，于8 000 r/min下离心10 min，将上清液在420 nm波长处测定吸光度，以吸光度值表示色度[16]。

1.4.5 果酒理化指标测定 还原糖、酒精度参照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定。

甘油质量浓度测定：高效液相色谱法[17]。

2 结果与分析

2.1 GSH对多酚褐变的抑制效果

以鲜榨苹果汁为研究对象，以VC、L-cys及SO2为对照，探讨GSH对多酚褐变的抑制效果，试验结果见图1。可以看出，作为应用最广泛的化学添加剂，SO2表现出最强的抑制作用。但大量研究结果表明，SO2对人体健康会产生很大的危害，这一缺点在一定程度上限制了它的使用。VC的抑制褐变效果较差，VC极易氧化分解，又可与游离氨基酸反应，生成色素，随着时间的延长，反而会使色泽加深[18]。L-cys对苹果汁的抑制效果稍优于VC，但加入L-cys后，果汁中的氨基酸含量增加，加重了美拉德反应，果汁颜色有变红的趋势，限制了L-cys的应用。

图1 不同抗氧化剂对鲜榨苹果汁褐变的影响Fig.1 Effect of different antioxidants on browning degree of fresh apple juice

由图可知，GSH对苹果汁褐变的抑制效果仅次于SO2，且随着浓度的增加，褐变度趋于线性降低。GSH由于含有巯基而具有还原性，可以抑制果汁及果酒褐变。在引起褐变的酶促氧化过程中，GSH对多酚氧化酶的活性有一定抑制作用，在一定程度上抑制了酶促氧化。GSH可结合酚类物质氧化后生成的醌，形成无色的羟醌类物质，降低了果汁及果酒的褐变度[18]。GSH作为一种具有抗氧化、清除自由基作用的天然酶促褐变抑制剂，可用其代替传统化学抗氧化剂SO2用于苹果汁及苹果酒酿造生产。

2.2 高产谷胱甘肽果酒酵母的筛选

2.2.1 酵母菌株发酵力比较 酵母菌的发酵力是反映酵母对各种糖类的发酵能力的重要指标。以CO2失重量为指标衡量酵母菌的发酵速率，是衡量酵母产酒能力的一个重要指标。14株酿酒酵母菌株发酵力结果见图2，由图可见，14株酿酒酵母的发酵能力有显著差别，试验菌株 Y1401、01、Y-18、06#的发酵力较强于其它菌株，且在第4天CO2失重量达到最大，之后趋于平缓。

图2 不同酵母菌株发酵力Fig.2 Fermentation capacity of different yeasts

2.2.2 酵母菌耐乙醇能力比较 一般来说，酵母细胞的发酵能力与菌株对酒精的耐性成正相关。由图3可知，不同酵母菌对乙醇的耐受性不同，随着培养基中乙醇浓度的增加，酵母菌发酵液的OD600值不断降低，在乙醇浓度大于10%时，酵母细胞的生长受到了很大抑制。从整个变化趋势来看，耐乙醇能力较强的酵母菌为 01、06#、Y1403、Y-18、02 菌株。

图3 不同乙醇浓度下酵母的耐受性Fig.3 Tolerance ofyeastsunder differentethanol concentration

2.2.3 酵母菌pH耐受性 随着培养基pH值的降低，14株酿酒酵母的生长能力整体呈下降趋势，在pH 2.0～3.0之间，酵母菌的生长受到很大程度抑制，由于此范围并不是苹果酒酿造的最适pH范围，所以不会对苹果酒发酵产生不良影响，见图4。Y-18对pH的耐受性较强，OD值的波动较平缓，这说明Y-18菌株对酸性环境的适应能力较强于其它菌株。

图4 不同pH值下酵母菌的耐受性Fig.4 Tolerance of yeasts to pH

2.2.4 酵母菌产GSH能力分析 对14株酿酒酵母的生物量和产GSH能力进行测定，结果发现不同酵母菌产GSH能力有较大差别，且pH对发酵液中GSH的质量浓度影响较大。pH是微生物生长的一个重要的环境条件，对微生物的生长、发育以及代谢过程都有很大的影响。当细胞处于不正常的环境中时，出于保护自身的本能和抵御外界环境伤害的需要，细胞可能会对其代谢产物的合成和分泌做出调整。研究表明，GSH在微生物抵抗酸胁迫过程中具有积极作用[19]。苹果酒发酵pH为3.2～4.2，当酵母细胞遭遇低pH胁迫时，细胞能以增加GSH合成并向胞外分泌GSH的方式来响应和抵御外界pH的不断降低。

由表1可以看出，在pH 3.5条件下，酵母菌发酵液中的GSH质量浓度显著高于pH 6.5时的GSH质量浓度，说明酸性环境刺激了酵母菌向胞外分泌GSH能力，而不同酵母细胞对外界环境的响应能力差异较大。在pH 3.5条件下，发酵液中GSH质量浓度及胞外胞内GSH质量浓度较高的菌株为Y-18、03、04#、01、02、RW、06#、07# 菌株，其中 Y-18 及 03菌株发酵液的GSH质量浓度显著高于其它菌株。目前，针对GSH胞外释放的研究较少，促进GSH向胞外分泌的方法主要有2种：胁迫控制及表面活性剂处理。冮洁[20]等研究发现，在加入0.3%Triton X-100后，胞外GSH质量浓度最高可达到29.03 mg/L，但细胞生长受到了很大程度的抑制，酿酒酵母Y-18在未经表面活性剂处理的条件下GSH胞外质量浓度达到29.5 mg/L，表现出一定的优越性。

表1 不同酵母菌株生物量及GSH质量浓度的比较Table 1 Comparison of biomass and GSH content among different yeast strains

综合考虑酵母菌的发酵力、耐受性及产GSH能力，筛选酿酒酵母Y-18作为高产GSH的果酒酵母菌株，该菌株在苹果酒发酵pH范围内有优良的发酵性能，产GSH能力显著强于其它菌株。

2.3 高产GSH果酒发酵苹果酒的性能测定

2.3.1 发酵过程中还原糖、乙醇的变化 对Y-18菌株和4株发酵力或产GSH能力较强的对照菌03、04#、06#、02进行苹果酒发酵试验，从图5可以看出，酵母菌在前4 d还原糖量迅速下降，酒精分数近似线性增长，主发酵进行到第5天后还原糖量和酒精分数趋于平缓。通过与对照菌株比较可以发现，03菌株发酵能力较弱，不适合苹果酒发酵，而Y-18菌株的发酵度平缓，能更好地防止杂菌污染，发酵结束后酒精度达到11%左右，是优良的酵母菌种。

图5 发酵过程中的还原糖、酒精度变化曲线Fig.5 Curve of reducing sugar and alcohol concentration in fermentation

2.3.2 发酵过程中甘油质量浓度的变化 甘油是酵母菌酒精发酵过程中的副产物，具有甜味，可用于平衡酒中的酸感，增加口感复杂性，是高品质果酒的重要成分。由图6可知，酵母菌在第1天甘油质量浓度迅速增加，之后波动较小。菌株Y-18发酵结束后，发酵液中甘油质量浓度为5.6 g/L，约为对照菌的1.5～2倍。研究表明，当酵母细胞处于高渗透压环境时，甘油被诱导合成以提高胞内渗透压，其对细胞中的酶和生物大分子的结构进行较大程度的保护。因此，发酵过程中能生产甘油的酵母通常具有一定的渗透压耐受能力[21]。

图6 发酵过程中的甘油质量浓度变化曲线Fig.6 Curve of glycerin content in fermentation

2.3.3 发酵过程中色度的变化 在果酒发酵过程中，既有酶促褐变又有非酶促褐变。酶促褐变主要发生在果酒发酵的前期，参与酶促褐变的酶主要是多酚氧化酶（PPO），它能催化酚类物质氧化成醌类物质，醌类物质易进一步聚合形成黑色素。非酶促褐变主要有美拉德反应、焦糖化反应、抗坏血酸氧化分解反应、多元酚氧化缩合反应等[22]。

苹果酒发酵液的色度变化如图7所示。随着发酵时间的推移，4株对照菌发酵液的色度呈先下降后趋于平缓的趋势，Y-18菌株发酵液色度下降趋势显著。在发酵过程中，Y-18菌株发酵液的色度维持在较低水平，在第5天色度降低40.4%，发酵结束后色度显著低于其余对照菌株。

图7 发酵过程中的色度变化曲线Fig.7 Curve of color value in fermentation

2.3.4 发酵过程中GSH质量浓度的变化 在苹果酒发酵过程中，发酵液中GSH质量浓度处于动态变化中，GSH主要由酵母菌代谢产生，其参与发酵过程中的抗氧化过程，GSH可结合酚类物质氧化后生成的醌，形成无色的羟醌类物质，对果酒褐变的抑制及抗氧化性的提高影响显著。由图8可以看出，不同酵母菌发酵液的GSH质量浓度各不相同，但趋势较为一致，在第2天，GSH质量浓度达到最高值。研究表明，不同酵母菌发酵的果酒GSH质量浓度差异较大，Giuseppe[23]等对发酵结束的白葡萄酒中的GSH质量浓度进行测定，发现其质量浓度仅为0～2 mg/L，且随着陈化时间的延长逐渐减少。Y-18菌株在发酵过程中发酵液的GSH质量浓度最高可达14.39 mg/L，具有明显的优势。发酵结束后Y-18菌株发酵苹果酒的GSH质量浓度为5.82 mg/L，显著高于其它对照菌株。

图8 发酵过程中的GSH质量浓度变化曲线Fig.8 Curve of GSH content in fermentation

2.3.5 不同酵母菌发酵苹果酒的感官特征

不同酵母发酵苹果酒的感官分析见表2。

表2 不同酵母菌发酵苹果酒感官分析Table 2 Organoleptic evaluation of the cider brewed by different yeast strains

3 结语

考察了GSH对多酚褐变的抑制效应。结果表明，与常用护色剂 SO2、VC、L-cys相比，GSH 抑制苹果汁褐变能力优于VC和L-cys，是一种很强的还原剂。

以14株果酒酵母为备选菌株，比较了酵母菌的发酵力、耐酒精、耐pH能力，结果表明，菌株Y1401、01、Y-18、06# 的发酵力较强。 耐乙醇能力较强的酵母菌为 01、06#、Y1403、Y-18、02 菌株。pH 是微生物生长的一个重要的环境条件，在pH 2.0～3.0之间，酵母菌的生长受到一定程度抑制，而Y-18菌株对pH的耐受性较强，对酸性环境的适应能力较强于其它菌株。

通过对14株酿酒酵母产GSH能力进行比较，结果发现，在pH 3.5条件下，酸性环境刺激酵母菌向胞外分泌GSH，发酵液中GSH质量浓度及GSH质量浓度较高的菌株为 Y-18、03、04#、01、02、YRW、06#、07#，其中Y-18及03菌株发酵液的GSH质量浓度显著高于其它菌株。综合以上指标，选择Y-18作为高产GSH的果酒酵母菌株，用于苹果酒发酵试验。

本试验对Y-18菌株和4株发酵力或产GSH能力较强的对照菌 03、04#、06#、02进行苹果酒发酵试验。结果表明，Y-18菌株的发酵度平缓，发酵结束后酒精分数达到11%左右，是优良的酵母菌种。发酵过程中能生产甘油的酵母通常具有一定的渗透压耐受能力，菌株Y-18发酵苹果酒甘油质量浓度为5.6 g/L，约为其它菌株的1.5～2倍。随着发酵时间的推移，4株对照菌发酵液的色度呈先下降后趋于平缓的趋势，Y-18菌株发酵液色度显著低于其它菌株。而GSH质量浓度在发酵过程中处于动态变化，在第2天达到最高值，Y-18菌株发酵液中GSH质量浓度最高达14.39 mg/L。

综上，GSH对抑制多酚褐变具有较好的效果，而高产GSH果酒菌株Y-18能在降低果酒褐变值的同时保持良好的发酵特性，在提高果酒安全性的前提下利用生物方法减少褐变对果酒品质的影响，从而为高品质果酒的开发提供新的思路和参考。