甘氨酸对H2O2诱导氧化应激的小鼠胚胎抗氧化能力的影响

周 晶，柳海星，李钟淑，方南洙

（延边大学农学院，吉林延边 133000）

活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是指在动物机体内由氧构成且活性高的一类化合物的总称，其中最主要含氧自由基为超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH）[1]。H2O2是最常见的ROS物质，它在生物体内的来源主要是O2-的歧化反应。生理水平的ROS在生物体的各种信号反应中充当信使，如细胞增殖、分化和内源基因的表达等[2]。然而，当ROS生成量超过机体调控指标时，就会使细胞中蛋白质、脂质和DNA等大分子过度氧化，进一步威胁到生物体内各种生理生化反应的进行。

胚胎在母体发育过程中，因受到氧化-还原机制的保护[3]，几乎不出现发育阻滞现象。一旦离开妊娠母体，胚胎的有氧代谢就会加强，同时又缺乏体内抗氧化酶的中和，细胞的氧化-还原系统会发生紊乱，这些扰乱胚胎正常发育的氧化现象统称为氧化应激（Oxidative Stress，OS）[4]。Nrf2信号通路是细胞抵御OS的重要防御机制，其调控的下游抗氧化酶在细胞防御中发挥重要作用[5]。Nrf2通路主要包括过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化基因[6]。同时，Nrf2因子被认为是防止细胞或组织受ROS影响而引起损伤的一个关键的防护因子，如高浓度的ROS诱发细胞核内Nrf2的积累以及Nrf2通路的激活，从而提高细胞内部抗氧化酶的活性以达到全面清除ROS的效果[7]。

甘氨酸（Glycine，Gly）是一种抗氧化剂，具有抗炎、免疫调节和细胞保护等作用[8-9]。Gly可在细胞、器官和整体水平上杜绝有害物质对细胞造成损伤[10]，包括ROS的氧化作用。有实验表明，培养液中添加抗氧化剂能有效克服胚胎发育阻滞[11]。但是，Gly对氧化应激小鼠胚胎的作用及机理未被阐明，对此，本实验在细胞和分子水平上研究Gly对小鼠胚胎抗氧化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 实验动物为健康且性成熟的昆明系雌性小白鼠，购自延边大学实验动物中心。小鼠均饲养在24℃环境中，光照周期为12 h（08:00—20:00），黑暗周期为12 h（20:00—08:00）。

1.1.2 实验试剂 孕马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）购买于宁波激素有限公司；Gly（货号：ST085）购买于碧云天公司；Qiagen RNeasy Mini Kit试剂盒购买于德国QIAGEN公司；PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒购买于大连宝生物工程有限公司；2×Taq PCR Master Mix购买于天根生化科技有限公司；其他相关药品非特殊说明均购自Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超数排卵 实验采用PMSG-hCG法对小鼠进行超数排卵处理，即将挑选健康、6～8周龄的雌性小鼠于第1天腹腔注射10 IU PMSG，48 h后再腹腔注射10 IU hCG，然后与成年公鼠进行1对1合笼交配，合笼15 h后检查阴道栓。

1.2.2 胚胎的收集及培养 在注射hCG 20～22 h，采用脱颈法处死见栓母鼠，在无菌条件下取出胚胎并放入透明质酸酶中脱去卵丘颗粒细胞。4 min后用M16培养液清洗3遍，然后转移到相应培养小滴中，在饱和湿度、5% CO2气相条件、37℃的培养箱中培养、孵育。

1.2.3 Gly浓度的筛选 1-cell胚胎于0、1、4、7、10 mmol/L Gly培养液中孵育，分别在24、48、96 h观察胚胎的发育情况并记录下卵裂率、4-cell和囊胚的发育率，以筛选出利于胚胎发育的最佳Gly浓度。

1.2.4 胚胎氧化应激模型的建立 胡德宝等[12]研究表明，H2O2引起OS的有效致死浓度为25 μmol/L。因此，本实验采用25 μmol/L H2O2建立氧化应激模型。将收集的胚胎置于25 μmol/L的H2O2中孵育30 min后，分别在M16培养液和最佳浓度Gly的培养液中进行培养，未经H2O2处理的胚胎作为对照组。

1.2.5 胚胎内部ROS水平的检测 囊胚期胚胎置于

1 mg/mL PVA小滴中洗涤3遍，然后避光置于10 μmol/L的DCHFDA染色液微滴中在培养箱内染色15 min；将染色后的囊胚用PVA清洗3遍，再分别放入一小滴M16中，于荧光显微镜下进行波长为535 nm的蓝色荧光激发，显色2 min后拍照。用Image J 1.49对荧光图片量化分析，结果用平均荧光强度相对值表示。实验重复5次。

1.2.6 总RNA提取及cDNA合成 培养 96 h后收集囊胚期胚胎17个（置于-80℃储存），胚胎总RNA提取根据Qiagen RNeasy Mini Kit试剂盒用法说明进行操作。总RNA提取后，根据PrimeScript™ RT Master Mix试剂盒用法说明进行反转录，合成的cDNA保存在-20℃备用。

1.2.7 巢式 PCR 应用 2×Taq PCR MasterMix 进行 12.5 μL体系的巢式PCR反应。反应体系：模板2 μL，5 μmol/L上、下 游引物（表 1）各 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 6.5 μL，ddH2O22 μL。反应程序：第1次PCR 95℃预变性3 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃聚合30 s，共进行30个循环；最后72℃延伸5 min。第2次PCR 95℃ 预变性 3 min；95℃ 变性 30 s，57℃ 退火 30 s，72℃聚合30 s，共进行35个循环；最后72℃延伸5 min。5 μL的PCR产物应用于1%琼脂糖凝胶电泳，随后用LANE 1D Analysis Software进行IOD值分析。1.3统计分析 每组数据至少重复3～5次。数据应用SPSS 17.0一般线性模型的单因素方差分析进行差异显著性分析，结果用平均值±标准误表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＞0.05为差异不显著。

表1 引物序列

2 结 果

2.1 不同浓度Gly对小鼠胚胎发育的影响 从表2可知，各组间的卵裂率无显著性差异（P＞0.05）；4 mmol/L Gly处理组4-cell发育率显著高于10 mmol/L处理组（P＜0.05），与其他各组无显著性差异（P＞0.05）；4 mmol/L Gly处理组囊胚发育率显著高于其他组（P＜0.05），其余各组间无显著性差异（P＞0.05）。由此可见，4 mmol/L Gly能有效提高胚胎发育率。

2.2 Gly对氧化应激小鼠胚胎的影响 从表3可知，H2O2+Gly处理组的4-cell发育率极显著高于H2O2组（P＜0.01），其囊胚的发育水平显著高于H2O2组（P＜0.05）；各处理组的卵裂率无显著性差异（P＞0.05）。2.3 Gly对囊胚期胚胎ROS水平的影响 如图1所示，对照组和H2O2+Gly处理组ROS荧光强度分别极显著（P＜0.01）和显著（P＜0.05）低于H2O2处理组，而对照组与H2O2+Gly处理组没有显著性差异（P＞0.05）。2.4 Gly对胚胎内源性抗氧化酶表达的影响 由图2可知，Gly能显著提高CAT（P＜0.05）和SOD1（P＜0.01）基因的表达水平，但对SOD2基因的表达无影响（P＞0.05）。

3 讨 论

图1 囊胚ROS荧光染色图（A）及其定量分析图(B)

临床研究表明，补充Gly可以潜在地改善健康指标、协助控制代谢和预防各种疾病的发生[13]。高浓度Gly能帮助胚胎克服渗透压，进而有利于胚胎在体外的发育[14]。然而，本研究发现，对于小鼠胚胎来说，4 mmol/L Gly才能有效提高其在体外培养中的发育率。氨基酸作为一种渗透物时具有抗氧化作用，通过降低渗透压来保护分裂阶段的胚胎免受ROS损伤，并改善植入前小鼠胚胎的发育[15]。但本实验结果表明，4 mmol/L Gly处理不能显著提高4-cell发育率，而只对囊胚发育率有显著性影响。因此证明，4 mmol/L Gly对小鼠胚胎的抗氧化作用主要体现在囊胚时期。相关实验表明，Gly的抗氧化作用需要其他物质的协同才能更有效，如Tomomi等[16]研究发现，葡萄糖和Gly协同作用可提高猪囊胚在体外的发育率，胚胎的孵化数量较不添加或只添加Gly时显著增加。本实验中M16培养液只含有葡萄糖成分，Gly+H2O2处理组的小鼠胚胎4-cell发育率和囊胚发育率显著高于H2O2处理组，这与上述研究结果一致。

表2 Gly对小鼠合子期胚胎发育的影响

表3 Gly对氧化应激小鼠胚胎的影响

图2 囊胚期胚胎抗氧化酶基因表达的PCR图（A）及其定量分析图（B）

实际上，胚胎在体外的生存环境很难与体内环境相同，同时胚胎的抗氧化能力也有一定限度，所以减少胚胎受到的OS十分关键。机体的OS反应多是由于体内ROS水平升高而造成的，而H2O2是引起ROS水平上升的主要自由基之一[17]。本实验在H2O2诱导氧化应激的基础上，发现Gly能明显阻止H2O2导致的细胞内ROS水平升高，并改善小鼠胚胎发育到囊胚阶段的阻滞现象，这进一步证明了Gly可减缓胚胎在体外发育时受到OS。

胚胎内的ROS水平是由机体氧化-还原平衡和CAT、SOD等抗氧化酶来一起调控的[18]。当胚胎自身受到OS时，会激活Nrf2抗氧化通路。其中，Nrf2是细胞防御OS反应的关键因子，其在保护细胞免受氧化和亲电子应激中起重要作用[19]。在生理条件下，Nrf2处于细胞质中，逐渐被蛋白酶体等降解，只有当ROS激增即受到OS时，Nrf2的降解才被停止并转运到细胞核内。在核内，Nrf2会调节启动子区域的抗氧化基因转录并表达。例如，斑马鱼胚胎内ROS剧增时，会引起Nrf2活动的启停，过程中伴随一系列抗氧化酶活性增强[20]。本实验中，Gly能显著上调CAT和SOD1抗氧化基因的表达，但是对SOD2基因的表达无影响。由此得知，Gly可能通过上述Nrf2机制来提高小鼠胚胎的抗氧化能力。

以上实验结果证实了Gly能够有效地清除胚胎发育过程中产生的过量ROS，进一步推断Gly对小鼠胚胎体外发育具有抗氧化作用。