一种羧甲基茯苓多糖的结构及生物活性

刘晓菲，胡双飞，张学武

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

茯苓为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核[1]，收载于《中国药典》，位列中药“四君八珍”之中，别称玉灵、茯灵、松苓和茯菟等，具有很高的食补和药用价值，具有祛湿利尿、健脾和胃及安神宁心等功效，是一种药食两用的传统中药材。茯苓多糖（Pachyman）为茯苓的主要有效成分，占茯苓菌核的80%以上。大量研究发现茯苓多糖具有多种生物活性[2～4]。茯苓多糖主要包括中性多糖和酸性多糖，其中具有水溶性的中性多糖比例极小，而含有的大量的酸性多糖为碱溶性多糖，水溶性较差，不利于人体吸收，故临床应用受到很大的限制。研究发现多糖的药理活性与其溶解度有着密切的关系，水溶性是多糖发挥生物学活性的重要条件之一。此外，单糖组成、糖苷键构型、连接方式以及分支度等结构信息都是影响多糖生物活性的重要因素。因此对碱溶性茯苓多糖进行化学修饰以改善其溶解性能、提升其生理功效，并研究多糖的结构与其活性之间的构效关系成为当前研究的热点。茯苓多糖经羧甲基化改性可得到水溶性羧甲基茯苓多糖（Carboxymethyl Pachmaran，CMP），具有抗肿瘤、抗炎和免疫增强等作用[5～7]。目前，对于茯苓多糖羧甲基化改性、纯化以及评价其生物活性，并分析其构效关系等系统的研究工作仍处于起步阶段，尤其是对纯化羧甲基茯苓多糖的抗炎作用的研究鲜有报道。本实验通过对具有良好水溶性的羧甲基茯苓粗多糖进行分离纯化，表征其纯化产物结构以及评价其抗肿瘤和抗炎活性的研究，以期深层次研究羧甲基茯苓多糖结构与其药效的关系及进一步开发该多糖相关产品，并为将其应用于食品、医药、保健品以及化妆品化工等领域提供数据支持与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

羧甲基茯苓粗多糖，本实验室自制，羧甲基化取代度 0.52；人结肠癌细胞（HT-29）、人肝癌细胞（HepG-2）、人乳腺癌细胞（MCF-7）、人胃癌细胞（SGC-7901）、人肺癌细胞（A549），购自中山大学动物细胞实验室；小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7），广东省人民医院馈赠；DEAE-52纤维素、Sephadex-G200、Sephadex-G150上海源叶生物科技有限公司；Mouse TNF-α Elisa kit、Mouse IL-1β Elisa kit、Mouse IL-6 Elisa kit，欣博盛生物科技有限公司；RPMI-1640培养基、DMEM高糖基础培养基，Gibco公司；McCoy’s 5A基础培养基，杭州吉诺生物医药技术有限公司；L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-岩藻糖、D-葡萄糖、D-半乳糖标准品，Sigma公司；其它试剂为分析纯。

RE-52型旋转蒸发仪，上海荣生有限公司；HL-2B型恒流泵，上海精科实业有限公司；DBS-100型自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂；Model-550酶联免疫检测仪，Bio-Rad公司；MCO-17AC CO2培养箱，Sanyo公司；Allegra X-22R型高速冷冻离心机，Beckman Coulter公司；UV2300紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；Nexus FT-IR红外光谱仪，Thermo Nicolet公司；Waters Breeze GPC凝胶渗透色谱仪，美国沃特斯公司；Aglient 6890 N气相色谱系统，美国安捷伦公司；600 MHz核磁共振波谱仪，Bruck公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羧甲基茯苓多糖的纯化羧甲基茯苓粗多糖样品上 DEAE-52纤维素层析柱纯化，用0.2 mol/L NaCl溶液洗脱，采用苯酚-硫酸法进行跟踪检测，收集主要洗脱峰，真空浓缩、透析后冷冻干燥，获得羧甲基茯苓多糖 CMP4；Sephadex-G200和Sephadex-G150层析柱进一步纯化，0.2 mol/L NaCl溶液洗脱获得羧甲基茯苓多糖CMP44。

1.2.2 CMP44结构鉴定

1.2.2.1 纯度测定

CMP44溶于定量超纯水，取1.0 mL于25 mL比色管中，补加超纯水至2.00 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混合摇匀后快速加入浓硫酸5.00 mL，30 min沸水浴，静置冷却，以不加葡萄糖标准溶液比色管为空白对照，于490 nm处测其吸光度值；五个平行。根据葡萄糖标准曲线计算样品中多糖含量。

1.2.2.2 相对分子质量测定

GPC色谱条件：Water Breeze GPC凝胶渗透色谱仪，TOSOH公司色谱柱 TSK-GEL G-5000PWXLcolumn与TSK-GEL G-3000PWXLcolumn（7.8 mm×300 mm）串联，柱温：35 ℃；流动相0.02 mol/L KH2PO4溶液，pH值6.0，流速0.6 mL/min。

GPC校正曲线方程：葡聚糖标准品系列分别用流动相配制成1.0 mg/mL的标准溶液，进样量20 μL，采集色谱图。

CMP44用流动相配制成浓度为1.0 mg/mL的溶液，0.45 μm水相微孔滤膜过滤，进样量20 μL，采集色谱图。

1.2.2.3 紫外光谱分析

称取CMP44 1 mg，超纯水溶解，配成1 mg/mL的样液，以超纯水为空白对照，于200～400 nm波长范围内进行扫描分析。1.2.2.4 红外光谱分析

称取CMP44 2 mg，加入适量已干燥的KBr粉末，研磨均匀、压片，于400～4000 cm-1区间内进行扫描分析。

1.2.2.5 单糖组成分析

GC色谱条件：Aglient 6890 N气相色谱仪；DB-1701毛细管柱（30.0 m×320 μm×0.25 μm），进样前依次吡啶洗针3次，丙酮洗针3次；进样口温度设为 250 ℃，分流比 20∶1；载气氮气，流速为 40 mL/min；氢气流速为25 mL/min，空气流速为450 mL/min。程序升温：初始温度为180 ℃，保持2 min；2 ℃/min升温至220 ℃，保持1 min；7 ℃/min升温至250 ℃，保持1 min；检测器温度250 ℃；进样量1.0 μL。

样品水解：称取CMP44 10 mg于安瓿瓶内，加入2 mol/L的三氟乙酸溶液 4 mL，用酒精喷灯封口后110 ℃水解8 h。水解液冷却至室温，加入适量甲醇，减压浓缩蒸干，重复5次完全除去三氟乙酸。

单糖衍生化：水解物中加入0.5 mL吡啶和10 mg盐酸羟胺，90 ℃水浴并振荡反应30 min，冷却至室温后加入0.5 mL醋酸酐，90 ℃继续水浴30 min进行乙酰化处理；单糖标准品采用相同操作方法进行衍生化。

上述单糖气相衍生物经0.45 μm滤膜过滤，按照气相色谱条件，进行上机分析。

1.2.2.6 高碘酸氧化和Smith降解分析

高碘酸氧化：称取CMP44 20 mg，溶于15 mmol/L的NaIO4溶液。混匀后室温暗处反应，每间隔6 h取样，223 nm波长下测定其吸光度值，至值恒定后向体系中加入1.5 mL乙二醇终止反应。根据NaIO4标准曲线计算出高碘酸消耗量。将含有乙二醇的溶液放置20 min后，取2 mL，加入酚酞指示剂，已标定的NaOH标准溶液进行滴定，计算甲酸生成量。溶液剩余部分用于Smith降解反应。

Smith降解：将乙二醇处理后的溶液进行透析，流水、超纯水各24 h。减压浓缩后加入硼氢化钠进行还原，过夜。然后，用50%的醋酸调其pH值至6～7，中和剩余硼氢化钠，流水、超纯水各24 h透析。减压浓缩至干，加入2 mol/L三氟乙酸，110 ℃封管水解反应8 h乙酰化，GC上机分析，色谱条件同1.2.2.5。1.2.2.7 核磁共振分析

CMP44样品15 mg溶于0.5 mL重水中，溶解后转移至核磁管中，于600 MHz核磁共振仪上进行氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)分析，采用MestReNova-11.0.2软件对图谱进行分析。

1.2.2.8 三螺旋结构分析

称取CMP44 2 mg，加入超纯水和100 μmol/L刚果红试剂各2 mL，加入4 mol/L NaOH溶液，使溶液中碱浓度逐渐增加至0.5 mol/L，于400～600 nm波长范围内进行扫描，测定最大吸收波长。以不加CMP44样品的刚果红溶液为对照。横坐标NaOH浓度，纵坐标最大吸收波长绘制曲线。

1.2.3 CMP44体外抗肿瘤活性

1.2.3.1 样品溶液配制

CMP44以DMEM高糖基础培养基和McCoy’s 5A基础培养基分别配制成1000 μg/mL的多糖母液，0.22 μm滤膜过滤除菌，两倍稀释至不同浓度梯度，待用。

1.2.3.2 细胞培养

用DMEM高糖完全培养基（10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素）培养HepG-2、SGC-7901、MCF-7、A549细胞；McCoy’s 5A完全培养基（10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素）培养HT-29细胞。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.3.3 细胞增殖测定

采用MTT比色法[8]分析CMP44对五种肿瘤细胞增殖的抑制作用。取对数生长期细胞100 μL接种于96孔板，培养48 h。分别加入31.25～1000 μg/mL的CMP44和阳性药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）溶液，每孔加入200 μL，空白培养基为对照，每个样品设5个复孔，继续培养48 h。用PBS洗板2次，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液和180 μL相应基础培养液，培养4 h。取出去除含有MTT的培养液，加入150 μL DMSO振荡反应15 min，490 nm处测定其吸光度值。

细胞增殖抑制率(%)=(1-OD给药/OD对照)×100%

1.2.4 CMP44体外抗炎活性

1.2.4.1 样品溶液配制

CMP44以 RPMI-1640基础培养基配制成 1000 μg/mL的母液，0.22 μm滤膜过滤除菌，两倍稀释成不同浓度，待用。1.2.4.2 细胞培养

以RPMI-1640完全培养基（含8%胎牛血清）培养RAW264.7细胞。

1.2.4.3 细胞毒性测定

采用MTT比色法测定CMP44对RAW264.7细胞的毒性强弱，测定操作同1.2.3.3。1.2.4.4 实验分组

取对数生长期RAW264.7细胞，用血球平板计数调整细胞悬液密度约为1×105个/mL，反复吹打均匀，100 μL/孔接种于96孔板，培养24 h，吸除培养液，依照以下实验分组进行给药处理：Control组，细胞培养液100 μL；LPS组：LPS（终浓度1 μg/mL）细胞培养液100 μL；LPS+CMP44样品组：含LPS（终浓度 1 μg/mL）及 CMP44（31.25～1000 μg/mL）的细胞培养液100 μL；CMP44样品组：CMP44（31.25～1000 μg/mL）的细胞培养液100 μL。每组样本均设5个复孔。封板后培养24 h，收集上清液。

1.2.4.5 NO释放量测定

CMP44对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量测定采用Griess试剂法[9]。96孔板中加入已收集的上清液取100 μL，加入等体积 Griess试剂（0.1%的1-萘乙烯二胺与溶于5%磷酸中的1%对氨基苯磺酸等体积混合），室温下振荡反应10 min，540 nm处测定其吸光度值，根据NO2-标准曲线（NaNO2溶液0～200 μmol/L浓度与Griess试剂反应，以NO2-的浓度为横坐标、540 nm处吸光度值为纵坐标绘制曲线），计算细胞上清液中NO的释放量以及CMP44对NO释放的抑制率。

1.2.4.6 细胞因子释放量测定

CMP44对LPS诱导的RAW264.7细胞释放IL-6、TNF-α及IL-1β测定采用ELISA酶联免疫试剂盒，按照说明书进行操作。

1.3 统计分析

所有实验重复3次，数据以均数±标准差（¯x±s）表示，SPSS 19.0软件进行one-way ANOVA分析，两组间比较采用t检验，p＜0.05为差异显著，p＜0.01为差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 羧甲基茯苓多糖柱层析分离纯化

图1 DEAE-52纤维素层析柱洗脱曲线Fig.1 Elution curve of DEAE-52 cellulose column chromatography

羧甲基茯苓粗多糖以0.2 mol/L NaCl溶液为洗脱溶液，经DEAE-52纤维素层析柱纯化，苯酚-硫酸法检测的洗脱曲线如图1所示。从曲线图可见，洗脱峰峰形较对称，分离效果较好。收集主要组分对应的试管溶液，经真空浓缩、透析、冷冻干燥后获得组分，命名为CMP4。

图2 Sephadex-G200和Sephadex-G150葡聚糖凝胶层析柱洗脱曲线Fig.2 Elution curve of Sephadex-G200 and Sephadex-G150 column chromatography

CMP4经Sephadex-G200和Sephadex-G150葡聚糖凝胶层析柱纯化，以苯酚-硫酸法检测的洗脱曲线如图2所示。从曲线图可见，纯化得到单一且高而尖的对称洗脱峰，收集吸收峰对应主要试管溶液，经真空浓缩、透析、冷冻干燥后获得组分，命名为CMP44。

2.2 CMP44结构鉴定分析

2.2.1 纯度及相对分子质量

图3 CMP44的HPGPC色谱图Fig.3 Chromatography of CMP44 by HPGPC

CMP44的高效凝胶色谱图如图 3所示。从图可见，峰形为单一对称峰，相对分子质量约20.96×104u，洗脱峰处相对分子质量20.32×104u。根据苯酚-硫酸法测定的葡萄糖标准曲线y=7.4765x-0.0084，R2=0.9996，计算出CMP44的多糖含量为99%。

2.2.2 紫外光谱分析

CMP44在260 nm与280 nm处的紫外扫描结果均没有响应信号，说明纯化后的 CMP44不含有蛋白质和核酸，纯化效果较好。

2.2.3 红外光谱分析

图4 CMP44的红外光谱图Fig.4 Infrared spectrum diagram of the CMP44

CMP44的红外光谱扫描结果如图 4所示。4000～1650 cm-1呈现出典型的多糖特征吸收峰。其中，3600～3200 cm-1峰形相对较宽的吸收峰是糖链非游离O-H键伸缩振动产生。

3000～2800 cm-1吸收峰是糖类甲基、亚甲基C-H键伸缩振动产生。1630 cm-1与1420 cm-1附近处的吸收峰为羧甲基特征吸收峰，分别由C=O的非对称伸缩振动和次甲基伸缩振动产生。890 cm-1附近处为β-吡喃糖特征吸收峰。

2.2.4 单糖组成分析

CMP44经水解、乙酰化处理后的气相色谱结果表明，该多糖均一多糖，仅由D-葡萄糖一种单糖组成。

2.2.5 高碘酸氧化和Smith降解分析

根据已建立的高碘酸氧化反应标准曲线y=9.8983x+0.0017，R2=0.9997，计算得出 CMP44糖链中8.13%为（1→6）连接，79.71%为（1→3）连接，12.16%为（1→4）和（1→2）连接。Smith降解后经气相色谱结果表明，终产物中含有丙三醇和相应单糖葡萄糖，赤藓醇未检出。根据Smith降解反应原理，并结合高碘酸氧化分析结果推断出CMP44以（1→3）糖苷键为主链，含有（1→6）糖苷键支链，可能含有（1→2）糖苷键。

2.2.6 核磁共振波谱分析

图5 CMP44的1H(a)和13C(b)NMR图Fig.5 The 1H (a) and 13C (b) NMR spectrum of CMP44

CMP44的1H-NMR、13C-NMR谱如图5所示。从谱图分析可知，CMP44含有羧甲基，是以 β-(1,3)糖苷键为主链的D-葡聚糖结构。

2.2.7 三螺旋结构分析

图6 不同碱浓度下CMP44与刚果红混合液的最大吸收波长变化Fig.6 The maximum absorption wavelength of CMP44-Congo red mixture at different concentrations of NaOH solution

CMP44与刚果红混合溶液在0～0.5 mol/L NaOH溶液浓度范围内最大吸收波长的变化情况如图 6所示。从图可见，CMP44与刚果红混合液最大吸收波长显著高于不含多糖的刚果红溶液，说明该多糖能和刚果红形成络合物并发生红移，这种多糖与刚果红混合溶液在不同浓度碱溶液中表现出的特殊变化趋势，可以证明CMP44具有三螺旋结构。

2.3 CMP44体外抗肿瘤作用分析

MTT法测定的 CMP44对肿瘤细胞 HT-29、HepG-2、SGC-7901、MCF-7以及A549增殖的抑制率结果如表1所示。

从表1看出，在31.25～1000 μg/mL浓度范围内CMP44样品对五种肿瘤细胞均显示出不同程度的细胞增殖抑制活性，并且抑制作用呈剂量依赖性增强。CMP44对五种肿瘤细胞的生长抑制效果不及阳性药5-Fu。CMP44对SGC-7901抑制效果最好，HT-29细胞次之，A549细胞最差，IC50值分别为102.6 μg/mL、140.5 μg/mL、313.2 μg/mL。

表1 CMP44对五种癌细胞的抑制效果Table 1 Anti-proliferative effects of CMP44 on five cancer cells(¯x±s, n=5)(%)

2.4 CMP44体外抗炎作用分析

2.4.1 CMP44干预对RAW264.7细胞增殖影响

分别将不同浓度的CMP44溶液、CMP44溶液和LPS溶液与RAW264.7细胞共同孵育24 h，MTT法检测分析CMP44干预后细胞的生长情况，如图7所示。

图7 CMP44对RAW264.7细胞增殖的影响Fig.7 Effects of CMP44 on proliferation of RAW264.7 cells

从图 7（a）可见，LPS诱导能够显著激活RAW264.7细胞的活性（##p＜0.01）。无LPS诱导时，CMP44浓度≤500 μg/mL时，细胞存活率≥100%，无细胞毒性，在浓度为 1000 μg/mL时，CMP44对RAW264.7细胞生长抑制率仅为 5.28%，细胞存活率＞90%。从图7（b）可见，LPS诱导时，与LPS组相比，CMP44在低浓度范围时对 LPS诱导的RAW264.7细胞增殖体现出抑制作用，但显著不差异（p＞0.05）；浓度≥250 μg/mL 时，开始表现出显著的抑制作用（p＜0.01），并呈现浓度依赖性关系。结果说明，CMP44在31.25～1000 μg/mL 浓度内对RAW264.7细胞无明显细胞毒性，且对LPS诱导的RAW264.7细胞具有较强的抑制作用，因此可选择此浓度梯度用于后续实验研究。

2.4.2 CMP44干预对RAW264.7细胞释放NO的影响

LPS诱导活化巨噬细胞释放的NO可直接或间接的介导免疫反应与炎症反应。NO极其不稳定，细胞培养液中能够快速代谢成为NO2-，因此可采用Griess试剂法进行测定。结合已建立的 NO2-标准曲线y=0.00465x+0.02714，R2=0.9992，计算出 CMP44干预后RAW264.7细胞释放NO含量如图8所示。

图8 CMP44对RAW264.7细胞释放NO的影响Fig.8 Effects of CMP44 on NO of RAW264.7 cells

从图 8（a）可见，1 μg/mL浓度的 LPS刺激RAW264.7细胞后，LPS组细胞培养上清液中NO含量水平显著高于无LPS刺激Control组（##p＜0.01），因此说明LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症反应模型成功。与LPS组相比较，CMP44在31.25 μg/mL时即对LPS诱导的RAW264.7细胞NO释放量显著降低（**p＜0.01），具有剂量依赖性，剂量为 1000 μg/mL时NO释放抑制率达到46.87%。

结果表明，CMP44干预处理对 LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型有抑制作用，能够显著抑制由LPS诱导的RAW264.7细胞大量释放NO而发挥保护作用。由图 8（b）可见，CMP44干预也可诱导无LPS刺激的 RAW264.7细胞 NO产生，并且随着CMP44剂量的增加，生成量逐渐升高，与Control组相比较，CMP44从62.5 μg/mL剂量时开始对NO的生成出现显著性差异（##p＜0.01）。经CMP44处理后，NO生成量最大值是Control组的3.17倍。

2.4.3 CMP44干预对 RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α 及 IL-1β 的影响

细胞因子在调节细胞免疫功能和介导炎症反应中起着重要的作用[10]。采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中细胞因子的IL-6、TNF-α与IL-1β的含量。CMP44干预对RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α及IL-1β的影响如表2所示。

从表2看出，1 μg/mL浓度的LPS诱导RAW264.7后，LPS组细胞上清液中IL-6、TNF-α及IL-1β含量明显高于Control组（##p＜0.01）。与LPS组相比较，CMP44干预从剂量31.25 μg/mL开始对RAW264.7细胞TNF-α、IL-6和IL-1β的释放量降低程度表现出显著性差异（*p＜0.01），抑制作用呈剂量依赖性，剂量为1000 μg/mL时，对TNF-α、IL-6和IL-1β的抑制率分别为79.48%、44.33%和34.72%。结果表明，CMP44处理能够显著抑制由LPS诱导的RAW264.7细胞大量释放炎症因子 TNF-α、IL-6和 IL-1β，具有较强的抗炎活性。

此外，CMP44处理还可诱导无 LPS刺激RAW264.7细胞的TNF-α、IL-6和IL-1β的产生，具有明显的剂量关系。与Control组相比较，CMP44从剂量125 μg/mL开始对TNF-α的表达出现显著性差异（##p＜0.01）；剂量62.5 μg/mL 开始对IL-6 的分泌出现显著性差异（#p＜0.01）；剂量 31.25 μg/mL 开始对 IL-1β的分泌出现显著性差异（#p＜0.05）。1000 μg/mL剂量时，CMP44对IL-6的激活最为显著，IL-6生成量达到Control组的13.37倍；对IL-1β的激活作用较强，IL-1β生成量是Control组的8.50倍；对TNF-α的激活作用较弱，TNF-α生成量仅为Control组的3.17倍。结果表明，CMP44能够诱导RAW264.7细胞生成NO、TNF-α、IL-6和IL-1β，呈剂量依赖性，具有显著的免疫调节活性。

表2 CMP44对RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响Table 2 Effects of CMP44 on cytokine secretion of RAW264.7 cells(¯x±s, n=5)

3 结论

3.1 多糖复杂的结构特征和成分组成决定其具有繁杂多样的生物学功能。多糖纯度、相对分子质量、糖苷键链接方式、修饰基团取代度大小以及高级结构等因素都与多糖的性质和活性密切相关[11,12]。分子结构的微小变化和立体结构因素也会影响多糖活性。此外多糖的纯度越高其相应的利用价值就会越大[13]。本实验对羧甲基化茯苓粗多糖依次经0.2 mol/L NaCl溶液洗脱 DEAE-52纤维素、Sephadex-G200和Sephadex-G150层析柱，纯化得到纯度99%、平均相对分子质量20.96×104u的高纯组分CMP44，是单糖组成为D-葡萄糖的均一多糖，主链结构为（1→3）-β-D-葡聚糖，含有少量（1→6）-β和（1→2）-β糖苷键，并且具有三螺旋结构。大量研究发现，β构型多糖大多具有较强的生物活性，且文献报道，含有一定比例（1→6）支链的（1→3）-β-D-葡聚糖则显示出极高的活性[14,15]，因此推测CMP44可能具有良好生物活性。

3.2 CMP44在31.25～1000 μg/mL浓度范围内对五种肿瘤实验细胞的增殖均表现出一定的抑制作用，具有较好的体外抗肿瘤活性，且呈一定的剂量依赖性，抗肿瘤作用大小顺序如下所示：SGC-7901＞HT-29＞HepG-2＞MCF-7＞A549。

同时，CMP44还能够激活小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞释放NO、TNF-α、IL-6和IL-1β，具备一定的免疫调节作用，且生成量随着CMP44添加浓度的增加而升高。因此推测CMP44可能具有增强机体免疫力和直接抑制肿瘤细胞生长的双重抗肿瘤作用。结合实验结果及文献报道，推测 CMP44所具有的（1→3）-β-D-吡喃葡聚糖基本骨架结构为其发挥抗肿瘤作用的基础[16]，另外，相对分子质量、分支度等也是影响其抗肿瘤活性的可能因素[17]。

3.3 此外，CMP44在31.25～1000 μg/mL 浓度范围内对RAW264.7细胞无细胞毒性，并且能够不同程度的抑制由LPS诱导的RAW264.7细胞NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的大量释放从而发挥抗炎和保护作用，因此提示 CMP44具有较强的增强机体免疫力和抗炎活性双向调节作用，其抗炎作用的发挥推测是通过抑制炎症细胞的活性和炎性细胞因子的合成与分泌，以此阻断其过量生成而导致的致炎作用，调节细胞因子网络恢复平衡；而其细胞免疫功能的发挥则可能与其调节相关细胞因子分泌、增强巨噬细胞吞噬能力有关[18]。

3.4 综上，纯化得到的羧甲基茯苓多糖CMP44具有良好的抗肿瘤作用和抗炎作用，同时还具有一定的调节免疫功能，提示其在开发肿瘤治疗药物、急慢性炎症相关性疾病的治疗药物以及增强机体免疫力保健品等诸多领域都具有较大的潜在应用价值。因此，有待于日后对 CMP44的生物活性开展动物实验以进一步验证其活性，并借助蛋白组学、基因组学和代谢组学等多组学相关分析技术在各个水平上进行探讨研究其作用机理，为临床应用奠定理论基础。