基于3D打印的血型检测微流控芯片研究

许 雪， 陈 曦， 赵佳敏， 张自力， 李永猛

(河北工业大学人工智能与数据科学学院，天津 300130)

0 引 言

随着大数据时代的到来，临床血型即时检测工作日益繁重。匹配错误会导致严重后果，因此必须保证献血与输血间血型的一致性。微柱凝胶检测法[1]是目前国际卫生组织特别推荐的方法，较之传统玻片法、试管法，其灵敏度可提高10倍以上，结果稳定便于检测。微流控芯片技术具备微量、高通等特点，可实现在微升级别上的集成分析以及各项操作与功能[2]，检测过程易实现自动化、批量化、高效化、精度化，被广泛用于医学检测、基因分析、细胞筛选等众多领域[3-4]。为提高检测精度，对使用的微流控芯片具有较高的要求。然而，微流装置的微细加工需要昂贵的实验室设备，虽然存在相对便宜的制造技术，如聚合物基（PDMS）微细加工，其利用模具的光刻制造来制备芯片，微流通道开放，并需要熟练的专业人员。此外，纸基微流控芯片或试纸对环境条件敏感，且需要实验室条件进行批量生产，耗时耗力。而一台3D打印机，可将多步骤集成到一个按钮中，能达到快速制备一张密闭高通流道微流控芯片的目的，通道更安全、可靠。同时，微流控芯片需要相对精确的3D打印，而现有大部分3D打印机中，FDM（熔融沉积型）精度不够，SLA（光固化）精度达到，但价格较高。液晶掩模（LCD masking），能即时打印，但缺点是LCD屏易损易老化，可选范围少，成本相对较高。因此，本文采用目前流行的一种基于面投影，逐层光固化的高精度数字光处理（digital light processing，DLP）3D打印技术，采用微升级工艺进行微流控芯片的制备。较传统制备方法，速度更快，通道精度更高；通道密闭，安全性能更好，同时相对于LCD成本更低，选择范围更广，能满足对血型的快速即时检测要求。

3D打印技术制造方法便捷，同时拥有较高精度，已有很多研究将其应用于微流控芯片的加工中[5]。如Spivey等[6]使用基于DLP技术的3D打印机加工了用于研究细胞衰老的微流控芯片，精度可达4 μm。然而，3D打印与医学诊断芯片相结合的应用还没有得到很好地探索，尤其对于微升级3D打印微流控芯片的制备，在速度和精度方面还有待发展。因此，设计研究一种密闭微通道的用于血型检测的3D微流控芯片很有必要。

1 方 法

1.1 DLP（数字光处理）3D打印技术

数字微镜装置的数字光处理（DLP）3D打印技术，较传统的微立体光刻技术，打印速度和准确度进一步提高[5]。DLP工作原理，如图1所示，在3D打印过程中，激光照射到一个由MEMS技术加工而成的微镜阵列上，通过微镜阵列对激光反射的控制（阵列角度±10°）达到选择性曝光光刻胶的目的，通过面成型代替点成型，光强分布均匀，稳定性强，同时可以达到工业级精度，大幅度减少打印时间，提高效率。

图1 DLP 3D打印技术工作原理

在3D打印微流控芯片过程中，激光对光敏树脂进行曝光固化的同时，调节升降台高度，采用下投影式，可动态地创造出每一层的光学图案，逐层打印，如图2所示，进而实现对整个3D微流控芯片的制备加工。

图2 3D打印下投影式成型机原理图

1.2 芯片的设计与制作

本文设计的血型检测微流控芯片，使用桌面级3D打印机，直接将三维设计软件AutoCAD的数字模型（输出为stl格式文件），通过计算机转换为特定厚度的截面数据，导入打印机，如图3所示。实现芯片的制备，降低了人为因素误差，更安全可靠。

图3 微流控芯片打印流程图

制备的微流控血型检测芯片如图4所示，尺寸为34 mm×33 mm×4 mm（长×宽×高）。

图4 血型检测微流控芯片概念图及实物图

1.2.1 芯片微通道反应腔结构

芯片的主要部分即微流道反应腔，该3D微流控芯片由6个规格相同的密闭微流通道反应腔（简称微流道）构成，分别为抗A、抗B、抗Rh（D）、对照A、B、D。该微流道灌装容积约为9 μL，要求灌入到血型卡每个微柱内药液均为7 μL。流道总长16 mm，从采样通道端口到入口储液池呈阶梯状，长度分别为4 mm，7 mm，5 mm，宽度分别为0.5 mm，1 mm，1.5 mm，深度分别为0.3 mm，0.5 mm，0.7 mm，每个单通道平面构型设计如图5所示，包括入口储液池、试剂反应腔、采样通道3个主要模块[7]，芯片微流道结构设计三维示意图见图6。

图5 芯片单通道平面构型图

1.2.2 微流控芯片的制备

本文使用DLP的3D打印机（闪铸Hunter），通过直接将AutoCAD数字设计导入打印机，创建单个血型检测微流控芯片，从而实现概念到芯片的制造。该项目所需材料还包括3D打印的耗材透明树脂，氢氧化钾（KOH），乙二醇，过氧化氢。打印完成后，用异丙醇清洗3D芯片，并用空气压缩机冲洗未固化的树脂[8]。为了增大芯片材料的亲水性[9]，进一步提高微通道质量，用0.1 mol/L KOH溶液活化树脂，再将3D打印的微流控芯片浸入含有1.82 mol/L KOH的纯乙二醇溶液中，在60℃下孵育2 h[9]，最后用水冲洗芯片，得到最终用于血型检测的微流控芯片。

图6 芯片微流道结构示意图（单位：mm）

1.3 微流控芯片检测识别

1.3.1 检测原理

基于微柱凝胶技术，采用正定型的方法进行检测，通过一次工序，在芯片入口储液池灌入体积比为3:2的葡聚糖凝胶与抗体的胶液混合物，其凝胶介质在50倍显微镜下如图7所示。

图7 凝胶型介质显微示意图

加入样本血液（每微通道约1 μL），采用离心机进行高速离心2 min。通过图像识别微流管道内红细胞凝集停留位置（如图8所示）：抗原抗体发生凝集时，凝集的红细胞停留在分离介质上层（+），为阳性反应；未发生凝集反应的，所有红细胞通过分离介质间隙，在微流道底部聚集（-），为阴性反应。最终，得到需要检测的对应血型。

图8 微流道凝胶抗体与红细胞抗原示意图

1.3.2 检测流程

采用实验室摄像机（型号：MV-EM200C，S/N：00464658），对微流控芯片进行拍摄。图9（a）、图9（c）为以LED为背光，红色光源摄像头照射下的芯片通道实物图。

将采集到的原始六通道图像进行剪裁，得到芯片单通道图像，对图像进行灰度化、噪声滤波，并进行二值化处理得到二值图，再通过Sobel算法[10]进行边缘处理（见图9（b）），拾取反应区形状特征，采用质心法得到质心标记图（如图10所示），以便更好地对血型检测结果进行自动识别。最后，通过识别二维码对微流控芯片进行记录，具体步骤如图11所示。

2 结果与分析

3D打印质量通过微观结构的扫描电子显微镜（SEM）成像来表征[7]，图9（d）为3D打印的微流控芯片微通道SEM图，显示打印图层细节（400 μm）。通过测试，血型检测微流控芯片满足实验要求。

2.1 芯片灌装高度

采用微柱凝胶血型检测法，对芯片微流道中试剂体积有严格要求，试剂过多或过少都会影响检测结果。因此灌装后需检测芯片的胶液混合相高度是否符合标准。

图10 质心标记图

图11 血型检测处理流程图

在已有数据中，选择了400张灌装后芯片进行高度测量。表1是部分芯片胶液混相高度数据。其中N为芯片序号，1-i为第1张卡的第i个（1≤i≤6）微柱管；M1为手工测量的胶液混相高度；P1为Sobel算法检测得到的胶液混相高度；误差E1=P1-M1；t为单张微流控芯片六微柱管高测量总耗时。

对2 000张所有采集的胶液混相高度误差数据作误差数据直方图并拟合分布曲线进行分析，如图12所示，由图像曲线可看出其分布近似于正态分布。

所以误差概率密度函数可表示为

式中 µ为均值， σ为标准差。近似计算可得，µ=−0.0401，σ=0.0401。由 3σ原则知，数值分布在(µ−3σ,µ+3σ)中的概率为0.997 4，超出这个范围的可能性不大于0.003，因此可以近似认为胶液高度误差在（–0.160 4，0.080 2）区间内，符合胶液高度测量的精度要求。即3D打印的微流控芯片，通道打印均匀，质量符合精度要求。

表1 血型检测微流控芯片微柱高度测量数据

图12 胶液混相高度误差分布（n=2 000）

2.2 芯片血型识别

在微流控芯片中灌入7 μL葡聚糖凝胶与抗体胶液混合试剂，进行独立重复血型检测实验[11]。人工手动识别作为对照实验记为A，微流控芯片图像识别记为B，实验样本分别取A组（1 182片）、B组（1 409片）。其中，人工识别采用传统方法进行滴定识别，而微流控芯片的血型检测，通过图像处理进行识别，血型检测识别结果见表2。

数据统计结果显示，微流控芯片图像识别，可在1 200 ms左右完成单样品图像检测，单张整体耗时3 min左右，较临床实际需求的5～20 min耗时较短，且样品识别率提高至99.29%。

表2 微流控芯片血型检测样本识别

3 结束语

本文采用基于DLP的光固化3D工艺技术，设计制备了一种用于快速检测血型的微流控芯片，利用该微流控芯片，对人体血液进行采样检测实验，并对血型检测结果进行分析。结果表明该芯片成功检测出样品血型种类，且检测成功率较高，整个过程耗时较短，具有易于操作、成本低、试剂消耗少、快速即时检测等特点。结合二维码等智能手段，为个性化智慧医院[12]的建立提供新的检测基础。本文对芯片的3D打印方法具有通用性，对打印复杂几何结构的微流控芯片，均具有适用性。