二极管阵列检测器波长校准方法研究及评价

杨三东， 艾 利， 封 娇， 唐 涛,， 王风云， 郝青丽， 李 彤

(1. 南京理工大学，江苏 南京 210094; 2. 大连依利特分析仪器有限公司，辽宁 大连 116023)

0 引 言

二极管阵列检测器（diode array detector，DAD或photo diode array ，PDA）是一种多通道光学吸收型检测器，以二极管阵列模块作为光探测器，可在几十至几百毫秒的时间内同时采集多个波长下的光强信息，可以用于对样品进行定性、定量以及反应动力学研究，常用于高效液相色谱系统中[1]。二极管阵列检测器主要由多色仪和配套的电路系统组成，其中多色仪的光路示意图如图1所示。由于零部件设计加工存在误差、光路调试过程存在不确定性，导致多色仪内阵列探测器所接收到的光谱情况存在差异。为了保证光谱数据的可靠性，需要对多色仪的波长进行校准。

图1 多色仪光路系统示意图

光源校准法和吸收光谱校准法是两种常用的波长校准方法。由于低压汞灯的光谱特征峰较多，且为线光源，多数仪器在组装调试过程中都使用低压汞灯作为波长校准光源[2]，波长校准结束后再将其更换为实际使用的光源—氘灯，有的仪器甚至将低压汞灯置于仪器内，便于仪器维护过程中使用。但是，通过Zemax软件模拟和实际调试中发现，当光源的中心偏离设计位置时，会使光路系统的分辨率降低、像差变大、光谱成像改变，从而使波长值出现偏差。对于不同的光源来说，光源中心位置出现偏差属于正常现象，因此若采用低压汞灯对多色仪进行校准，难免会降低波长校准的准确性。吸收光谱校准法通常以具有特征吸收波长的固体或液体作为校准物质。液相色谱仪检定规程JJG705—2014[3]规定用重铬酸钾溶液来检定紫外检测器，可将其用于波长校准。何海红[4]使用咖啡因溶液对检测器波长进行校准，发现其特征峰峰形比较尖锐。含有稀土元素的物质在紫外区具有特征吸收，适合用于波长校准过程[5-6]。ASTM E1657—98（2011）[7]中建议使用高氯酸铒溶液、高氯酸钬溶液、萘的甲醇溶液作为波长校准溶液。波长校准溶液的特征峰通常较宽，难以获得准确的峰值，从而影响波长校准的准确性。专利US6423249[8]利用掺杂了硝酸铒的溶胶凝胶玻璃作为波长校准物质，该物质在紫外可见波长范围内有多个尖锐的特征吸收峰，但该波长校准物质的制备过程比较复杂，不利于推广使用。

针对上述问题，本文采用仪器原位光源——内置氘灯，结合氧化钬玻璃的双校准源对二极管阵列检测器进行波长校准，设计了不同的校准方案，比较了它们的校准结果，并利用重铬酸钾溶液对波长校准结果进行了评价。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

自制光电二极管阵列检测器多色仪的光路系统基本结构与图1相同，其中，光学聚焦系统利用透镜将光聚焦在检测池的中心，检测池后再次通过配套的微透镜将光聚焦在0.1 mm的狭缝中心。通过狭缝的光由平场凹面光栅进行分光，所形成的光谱信息被阵列探测器接收检测。多色仪所用平场凹面光栅的直径50 mm，入臂和出臂分别为138.6 mm和132 mm。在阵列探测器上均匀排布512个光电二极管，并在位于光谱的380 nm附近放置长20 mm的380 nm滤光片，用于消除光栅分光产生的二级光谱。自主开发光谱专用采集软件，可采集512个光电二极管接收的能量值。TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），分辨率选择0.1 nm。

氧化钬标准品（GBW（E）130122，国防科技工业应用化学一级计量站），特征波长见表1。

表1 氧化钬标准品特征波长

0.05 mol/L硫酸溶液：量取2.7 mL浓硫酸定容至1 L，得到0.05 mol/L硫酸溶液。

0.06 g/L重铬酸钾溶液：称取0.06 g重铬酸钾，用0.05 mol/L硫酸溶液定容至1 L，得到0.06 g/L的重铬酸钾溶液。

1.2 扫描透过光谱与吸收光谱

打开氘灯，待能量稳定后，扫描每个光电二极管的能量值，E1～E512。将氧化钬玻璃置于光路中的检测池处，稳定几秒后，再次扫描每个光电二极管的能量值，得到E1'～E512'。若待测物为溶液，则先将检测池内充满空白溶液并扫描能量值，之后充满待测溶液并扫描能量值。利用公式（1）计算得到透过率T1～T512，或利用公式（2）得到吸光度A1～A512。以二极管编号为横坐标，透过率Tn或吸光度An为纵坐标作图，即获得待测物的透过光谱或吸收光谱。

1.3 波长校准原理

利用分光光度计或查阅相关文件得到光源发射光谱和物质的吸收或透过光谱的特征峰波长，然后利用二极管阵列检测器获得特征峰的二极管编号，再根据特征波长值和二极管编号拟合出二者的函数关系。利用此方程就可将二极管编号转化为准确的波长值，从而实现了对检测器波长的校准。由此过程可见，特征波长值的选择以及方程的拟合方式会影响到波长校准的结果。

1.4 波长校准评价指标

波长校准的结果可以用具有特征吸收峰的溶液进行评价，但这需要将溶液输送至检测池内。为了简化操作，可以选用氘灯发射光谱和钬玻璃的吸收光谱对波长校准结果进行评价，评价指标包括：校准结果的平均偏差（average deviation，AD）、偏差标准差（standard deviation，SD）和均方根误差（root mean square error，RMSE）。平均偏差可用于评价校准结果准确性的平均水平，偏差标准差可用于评价校准结果偏差的离散性，均方根误差可用于评价校准结果偏离标准值的程度，对较大或较小的偏差比较敏感。

2 结果与讨论

2.1 确定氧化钬玻璃的特征波长

氧化钬标准品外形尺寸与比色皿相同，一般用于校准分光光度计的波长，通常不适合安装到液相色谱检测器内，因此选用外形尺寸可定制的氧化钬玻璃作为波长校准的物质。利用分光光度计获得的氧化钬标准品和氧化钬玻璃的透过率曲线如图2所示，从图中读取峰值所对应波长值，并与氧化钬标准品证书上的认定值比较，结果表明，氧化钬标准品的实测特征波长值与认定值的偏差在0.6 nm以内，氧化钬标准品和氧化钬玻璃的特征波长值偏差在0.2 nm以内，因此氧化钬玻璃可以用于波长校准。考虑到分光光度计的偏差，所选用的特征波长值=认定值–（标准品实测波长值–氧化钬玻璃实测波长值）。

图2 氧化钬标准品和氧化钬玻璃的透过率曲线

2.2 波长标准值的选择对校准结果的影响

利用光电二极管阵列检测器多色仪获得的特征波长阵列编号和对应的波长值见表2。

表2 实测特征波长阵列编号和对应波长值

采用4种标准波长的取值方式对波长值y和阵列编号x进行线性拟合，得到的校准函数如表3所示。

将表2中的阵列编号代入表3的4个函数关系中，计算各校准后波长值的平均偏差（AD）、偏差标准差（SD）和均方根误差（RMSE），结果见表4。

对于取值方式1和2来说，只使用了氧化钬玻璃的特征波长来进行线性拟合校准，因此只在所选取的波长范围内校准结果较好，而在选取的特征波长区间之外，如656.1 nm附近的校准偏差较大。同理，取值方式3只使用了氘灯的两个特征波长进行校准，导致400 nm以下的校准结果偏差较大。与取值方式1～3相比，取值方式4选择了氧化钬玻璃的6个特征波长和氘灯的2个特征波长进行校准，在240～650 nm范围内的SD和RMSE均较小，说明此取值方式的校准结果偏差比较均衡。

从实际使用考虑，将全波长范围内的波长偏差控制在一个合理值以内，要优于波长偏差分布不均的情况。此类检测器的波长范围通常在190～800 nm，理论上，校准用的波长值应包括190 nm以下和800 nm以上才能保证全波长范围的准确性，但这样会增加校准源的成本，并且需要检测器能够检测到波长值小于190 nm和大于800 nm的光谱，同样会增加仪器的设计难度和研发成本。综合考虑，校准用波长值确定在241.5～656.1 nm范围内。

表3 4种波长标准值取值方式及对应的线性拟合函数

表4 4种线性拟合函数的波长校准结果

2.3 函数的拟合方式对校准结果的影响

光电二极管阵列检测器多色仪内的分光元件是平场凹面光栅，理论上这种光栅的线色散是一个固定值，即焦平面处单位距离的光谱宽度一致。作为光谱的接收元件，光电二极管在阵列上的排布理论上是等间距的，即单位距离的光电二极管个数一致。因此，光谱的波长和光电二极管的阵列编号之间应该是简单的线性关系。但实际上，由于光栅和二极管阵列的加工存在误差、光路调试也可能会存在一定偏差，所以波长值和光电二极管的阵列编号的关系只是近似线性，这种近似会降低波长校准的准确性[9]。

一种优化校准结果的方式是采用高次拟合函数。若对氧化钬玻璃的6个特征波长和氘灯2个特征波长分别采用二次和三次函数拟合方式，可分别得到函数关系5：

函数关系6：

函数关系5和函数关系6中的二次项和三次项即是对校准过程中的非线性部分进行调整，其系数往往很小。利用函数关系5和函数关系6对多色仪获得的氧化钬玻璃和氘灯特征波长所对应的阵列进行计算，得到的校准后波长值与特征波长值的偏差，同时与函数关系4的线性拟合结果对比，见表5。

表5 线性、二次曲线和三次曲线拟合函数的波长校准结果对比

由表中对比可以看出，当使用同一组校准波长值时，高次拟合函数方程的校准结果要优于线性拟合，且三次函数拟合的结果优于二次函数拟合的结果。尽管可以采用更高次的函数拟合结果进行波长校准，但这会增加校准过程的复杂性，且三次函数拟合校准结果的准确性对于多数紫外吸收型检测器来说已经足够。

另一种优化校准结果的方式是对阵列数进行开方处理，然后利用高次函数拟合方程进行校准。若对氧化钬玻璃的6个特征波长和氘灯2个特征波长对应的阵列数进行开平方处理，然后采用三次函数拟合进行校准，得到函数关系7：

计算得到的AD为6.55×10-4nm，SD为0.61 nm，RMSE为0.57 nm，SD和RMSE介于函数关系5和函数关系6的校准结果之间，同样优于函数关系4的校准结果。实际上，由于对阵列数进行了开平方处理，此时的函数关系7相当于在函数关系4的基础上增加1.5次项和0.5次项，所以此时的函数关系7比函数关系4能够更精确地描述阵列和波长的关系。如果对阵列数开高次方，其校准结果也会优于开平方的结果，但同样会增加校准过程的复杂性，开平方的拟合校准结果已经能够满足一般的校准需求。

2.4 波长校准结果的验证

使用校准用的特征波长值对校准结果进行评价能够在一定程度上反映校准结果的准确性，但仍需要选择其他的物质来进一步验证。重铬酸钾溶液在紫外区有4个特征波长，可以用来验证波长校准的结果。

空白选择0.05 mol/L硫酸溶液，重铬酸钾溶液作为样品，得到的吸收光谱图如图3所示，3次扫描的结果基本重复。对实验中4个特征波长所对应的阵列编号计算平均值，将其代入到函数关系5～7中，如表6所示。校准后的波长偏差的绝对值均不大于1 nm，因此说明3个函数关系均能够获得比较准确的校准结果。受多色仪光学分辨率和样品特征峰型的影响，3个函数关系的差别、优势均不明显，因此实际使用中需要根据多色仪系统的光学参数选择合适的校准函数。

图3 紫外吸收标准溶液的吸收光谱图

3 结束语

通过对自制光电二极管阵列检测器的波长进行校准，采用偏差平均值、偏差标准差、均方根误差比较了多种波长标准值的取值方式以及多种函数拟合方式对校准结果的影响。校准的比较结果表明，波长标准值覆盖范围越广，波长校准的准确性越高、偏差分布更均衡，且由于光学元件加工和调试过程存在的误差，多次函数拟合的校准结果要优于线性拟合的结果，对阵列进行开方处理后再校准，也有利于校准结果的改善。但实际使用中，还需要针对光学系统的参数情况选择最合适的校准方式，单纯追求高次函数拟合并不一定适合所有的光学系统。尽管多点高次函数拟合的波长校准方式能够将二极管阵列编号和特征波长值的关系更加准确地对应起来，光栅、探测器的加工精度控制和光路的设计、调试才是影响波长校准结果的根本因素，同样需要引起重视。

表6 重铬酸钾溶液特征峰校准后的结果