具有止血作用的纤维蛋白凝胶的制备及表征

陈俊英，高霞丽，谭建英

(西南交通大学材料科学与工程学院， 四川 成都 610031)

在手术过程中，出血部位的及时止血，不仅会提高手术成功率，而且可显著减少术后并发症。关于手术部位止血，已从古代物理方法止血、中草药止血发展为今天的止血材料止血。理想止血材料需满足快速止血、清洁安全、可促伤口愈合、价格便宜、使用方便等综合要求[1]。

目前发展的止血材料种类较多，如医用止血明胶、氧化纤维素与氧化纤维素网、α-氰基丙烯酸酯类组织胶和纤维蛋白胶等[2-10]。其中，纤维蛋白凝胶(fibrin-gels)是纤维蛋白单体在凝血酶及催化因子作用下聚合形成的生物大分子材料。在80年代就曾出现商业化纤维蛋白胶[11]。纤维蛋白凝胶的止血并不依赖凝血机制，故对存在凝血功能障碍的患者很适用[12-13]。此外，纤维蛋白凝胶还具有不传染病毒、室温下性质稳定等特点。除了用于局部止血、防止渗透和黏连外，纤维蛋白胶还应用于骨科领域，可作为缓释载体和骨材料支架等[14-17]。

本文模拟人体凝血反应的最后阶段，将纤维蛋白原和凝血酶制备成纤维蛋白凝胶，以获得一种具有止血功能的生物凝胶材料。研究中以纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液的体积比为变量，考察不同比例纤维蛋白凝胶的材料学性质、对血小板粘附的影响、与全血作用时对血栓形成量的影响等。筛选比例后，进一步了解纤维蛋白凝胶对伤口闭合情况的影响。该工作可为进一步研发纤维蛋白凝胶作为伤口辅料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纤维蛋白原(MW：340kDa，翊圣，上海)，凝血酶冻干粉(浙江杭康药业有限公司)，CaCl2溶液(自己配置)，生理盐水，PBS，2.5%戊二醛(实验室配置)，4%多聚甲醛(谷歌)，罗丹明染色剂，柠檬酸钠，富板浆(PRP，实验室提取)，贫板浆(PPP，实验室提取)，载玻片等。

1.2 仪器与设备

冷冻干燥机(FD-1C，北京德天佑科技发展有限公司)，扫描电子显微镜(QUANTA200，荷兰FEI公司)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS -IX51，日本)，恒温水浴锅(HH-W600，常州普天仪器制造有限公司)等。

1.3 试验方法

1.3.1 纤维蛋白凝胶的制备

将纤维蛋白原溶于生理盐水，形成10 mg/mL的纤维蛋白原溶液，将冻干人凝血酶溶于40 mmol/L氯化钙溶液，得到50 iu/mL的凝血酶溶液，37 ℃下，将纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液分别按1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的体积比混合形成凝胶。样品的标记设置如表1所示。

表1 样品设置

1.3.2 纤维蛋白凝胶的溶胀度分析

将1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纤维蛋白凝胶在PBS缓冲液中溶胀过夜，溶胀后取出凝胶并除去表面水份，称取溶胀后质量m1，然后在60 ℃左右恒温真空干燥至恒质量m2，利用(m1-m2)/m2计算其溶胀度。

1.3.3 HE染色分析

将1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纤维蛋白凝胶用4%多聚甲醛固定，然后将样品进行无水乙醇脱水，用石蜡包埋，切片后进行HE染色，用光镜观察凝胶结构。

1.3.4 扫描电子显微镜(SEM)分析

将1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纤维蛋白凝胶用2.5%戊二醛固定30 min，然后放入液氮罐。再将冷冻后的凝胶放入冷冻干燥机中冷冻干燥，固定，喷金，用扫描电子显微镜(SEM)观察凝胶的断面结构。

1.3.5 血小板粘附试验

将100 μL富板浆滴加于1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纤维蛋白凝胶表面，在37 ℃孵箱中静置45 min，然后用生理盐水清洗2～3遍，再用2.5%戊二醛固定，罗丹明染料染色，于荧光显微镜下观察血小板粘附情况，并拍照。

1.3.6 静态全血试验

将700 μL全血滴加于1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纤维蛋白凝胶表面，在37 ℃摇床上作用45 min，再用生理盐水清洗2～3遍，然后观察样品表面的血栓形成情况。

1.3.7 乳鼠创伤实验

用手术刀在乳鼠上制造相同的伤口模型后，将1 ∶5纤维蛋白凝胶(实验组)和含有生理盐水的纱布(对照组)敷在伤口表面，2 h后，观察比较乳鼠伤口部位的闭合情况。

2 结果与讨论

2.1 不同比例纤维蛋白凝胶的溶胀度比较

将1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纤维蛋白凝胶在PBS缓冲液中溶胀过夜后，所测得的溶胀度如图1所示。

图1 不同比例纤维蛋白凝胶的溶胀度

由图1可知，1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纤维蛋白凝胶的溶胀度不同，1 ∶1的溶胀度为53.8±5.4，1 ∶3的溶胀度为86.3±12.1，1 ∶5的溶胀度为78.8±10.1。随着凝血酶含量的增加，3种蛋白凝胶的溶胀度大小关系为1 ∶3>1 ∶5>1 ∶1。溶胀度变化与凝血酶含量有关，但不存在正相关关系，当纤维蛋白原和凝血酶比例为1 ∶3时，溶胀度最大。这是因为在1 ∶3样品中，两种分子的交联度达到最大，凝胶锁水能力最强，使1 ∶3纤维蛋白凝胶在三组样品中呈现最大溶胀度。

2.2 不同比例纤维蛋白凝胶的孔径大小比较

将1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纤维蛋白凝胶石蜡切片后，进行HE染色，用光镜观察凝胶内部结构，结果如图2所示。

图2 不同比例的纤维蛋白凝胶断面结构的HE染色图

从图中观察到形状不规则的网络状结构，孔与孔之间相互连通，说明1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纤维蛋白凝胶均为多孔纤维状网络结构，这种通孔有利于细胞三维生长，有利于营养及代谢物质的输送和排放，是促进伤口组织修复的理想结构。为了清楚观察纤维蛋白凝胶的孔洞尺寸，将1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纤维蛋白凝胶冷冻干燥并喷金后，进行凝胶断面结构的扫描电子显微镜(SEM)观察，结果如图3所示。

图3 不同比例的纤维蛋白凝胶断面结构的SEM图

由图3可知，纤维蛋白凝胶内部呈多孔网络状结构，孔道均匀，与HE染色结果对应。这种结构有利于营养物质的输运和细胞在其中的三维生长。随着凝血酶含量增加，纤维蛋白凝胶的孔洞尺寸发生变化，1 ∶3纤维蛋白凝胶的孔洞尺寸最小，为5～13 μm，1 ∶1和1 ∶5的孔洞尺寸相近，分别为11～41 μm和12～37 μm，均大于1 ∶3的孔洞尺寸。这是因为纤维蛋白凝胶形成时，纤维蛋白与凝血酶的交联度在1 ∶3时最大，致使凝胶致密度最高，孔洞尺寸最小。

2.3 不同比例纤维蛋白凝胶表面血小板粘附情况

通过罗丹明染色观察到的纤维蛋白凝胶表面血小板粘附情况如图4所示。

图4 不同比例纤维蛋白凝胶表面血小板粘附情况

由图4可知，载玻片表面有部分血小板粘附，活化轻微，其促凝效果较凝胶差。而在1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的凝胶表面，血小板发生集聚，活化明显，表明表面可促进血小板粘附和变形，有利于提高表明促凝血能力。血小板在凝胶表面发生激活与凝胶材料本身有关，纤维蛋白原和凝血酶都是参与凝血反应的重要物质，两者的存在会加速凝血反应的发生，进一步激活血小板。

2.4 不同比例纤维蛋白凝胶表面血栓的形成情况

将全血加在1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纤维蛋白凝胶表面，在37 ℃摇床上反应45 min，然后观察样品表面血栓形成情况，实验结果如图5所示。

图5 不同比例纤维蛋白凝胶表面全血试验结果

由图5可知，载玻片表面无血栓形成，而纤维蛋白凝胶表面已形成明显血栓。在3种纤维蛋白凝胶中，1 ∶5纤维蛋白凝胶形成的血栓量最多，载玻片与3种凝胶表面血栓形成量关系为1 ∶5>1 ∶3>1 ∶1>载玻片。该结果表明，纤维蛋白凝胶对伤口出血有良好止血作用。纤维蛋白凝胶通过形成血栓达到止血的目的，其原因可能如下。在凝血酶作用下，纤维蛋白原的ɑ链释放出A肽，β链释放出B肽，生成纤维蛋白单体。在这个过程中，因酸性多肽释放，负电性降低，纤维蛋白单体易聚合形成纤维蛋白多聚体。在Ca2+与活化XIII因子的进一步作用下，纤维蛋白单体之间以共价键相连，变成稳定的不溶性纤维蛋白凝块。形成凝胶后，通过以下机制发挥止血和封闭作用[15]：1)纤维蛋白凝胶的网络状结构，能吸附血液中的红细胞及血小板，形成血凝块；2)纤维蛋白凝胶形成后，机械强度增强，可以黏连组织及封闭伤口，与此同时，该凝胶能刺激毛细血管内的细胞生长，然后以纤维蛋白凝胶为支架形成肉芽组织，从而促进伤口愈合；3)纤维蛋白凝胶在伤口表面形成的膜状凝胶能防止损伤组织的细胞内溶酶体向细胞外泄漏，从而避免周围组织进一步受损，减少受伤表面出血，防止组织粘连。因此纤维蛋白凝胶在全血试验中，形成大量血栓。血栓形成量随凝血酶含量增加而增加，1 ∶5的纤维蛋白凝胶形成的血栓量最多。这可能是因为1 ∶5凝胶中凝血酶含量最多，而活化的凝血酶会加速凝血反应，使在相同时间内形成更多血栓。

2.5 乳鼠创伤实验

由全血试验可知，1 ∶5的纤维蛋白凝胶的血栓形成量最多，故在乳鼠创伤实验时，选1 ∶5的纤维蛋白凝胶作为乳鼠创伤实验的实验组，而对照组为含有生理盐水的医用纱布。用手术刀在乳鼠背部制造伤口后，分别将凝胶和纱布敷在伤口表面，2 h后比较乳鼠伤口的闭合情况，实验结果如图6所示。

注：Rat表示乳鼠固定方式和伤口，0 h表示凝胶刚贴上时的情况，10 min、30 min、1 h、1.5 h和2 h表示凝胶贴上10 min、3 min、1 h、1.5 h和2 h后的伤口愈合情况，箭头表示的是凝胶所在位置。

图6 贴上1 ∶5纤维蛋白凝胶的乳鼠的

伤口表面的愈合情况

由图6可知，纤维蛋白凝胶对伤口闭合具有促进作用。实验组伤口在0～30 min闭合情况与对照组无差别，但随时间增加，1.5 h后，纤维蛋白凝胶在伤口表面与伤口黏性连接，起到伤口黏合或伤口封闭作用，而对照组伤口仍处于裂开状态。该结果与纤维蛋白凝胶发挥伤口止血、封闭作用、促进组织再生的机制[18]有关。由于乳鼠毛细血管不发达，新陈代谢快，本身出血量不大，故纤维蛋白凝胶的止血效果无法充分体现。同时，纤维蛋白凝胶呈半透明状，有利于观察伤口的闭合情况，减少二次伤害。

3 综合分析与讨论

纤维蛋白凝胶止血效果好，组织相容性好，黏合性能良好，其止血并不依赖凝血机制，对存在凝血功能障碍的患者较适合[12-13]。研究中，将纤维蛋白原和凝血酶制备成纤维蛋白凝胶，结果见表2。纤维蛋白凝胶内部为多孔纤维状网络结构，孔与孔之间相互连通，1 ∶1和1 ∶5的孔洞尺寸相近，均大于1 ∶3，孔洞尺寸大小可以通过凝血酶含量进行调控。不同凝胶样品的溶胀度大小关系为1 ∶3>1 ∶5>1 ∶1，3种凝胶均能激活血小板，表面易形成血栓，其中1 ∶5凝胶表面形成的血栓量最多。这是因为1 ∶5的凝胶含凝血酶最多，而凝血酶经活化可加速凝血反应，使在相同条件下表面血栓形成量更多。与纱布相比，由于纤维蛋白凝胶的封闭作用，1 ∶5的纤维蛋白凝胶对伤口闭合有明显促进作用。纤维蛋白凝胶在促进伤口闭合方面的影响，需进一步研究[19-22]。

表2 实验结果汇总

注：a:“无”表示未进行相应实验；b：血小板形状和血栓形成量实验中，对照组为载玻片，乳鼠创伤实验中，对照组为含有生理盐水的纱布；c:“+”与血栓形成量呈正比。

4 结论

1)通过材料学表征发现，1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纤维蛋白凝胶内部均为多孔网络结构，其中1 ∶3纤维蛋白凝胶的孔径最小，溶胀度最大。

2)通过血小板粘附和全血试验发现，纤维蛋白凝胶能显著激活血小板，与血液接触时表面血栓形成能力强，其中1 ∶5的纤维蛋白凝胶表面血栓形成量最多。

3)乳鼠创伤实验发现，1 ∶5的纤维蛋白凝胶对伤口闭合有一定促进作用。

校友作者介绍

陈俊英(1968—)，女，四川威远人，西华大学材料系热加工工艺及设备专业1989级本科生。教授，博士生导师，四川省学术与技术带头人(2015—)。近20年来一直从事血液接触生物材料与人工器官表面改性方面的工作，主持国家自然科学基金项目4项，主研“973”课题3项、“863”计划1项。以第一或通信作者身份在Biomaterials、Actabiomaterialia、ACS Applied Materials & Interfaces等期刊上发表SCI收录论文30余篇，参编《Biomedical Nanomaterials》《组织诱导性生物材料国际发展动态》等专著。获授权中国发明专利14项，转化成果1项。获四川省科学技术进步一等奖、教育部技术发明二等奖、中国生物医学工程学会黄家驷生物医学工程奖二等奖各1项。