间充质干细胞和淋巴细胞分泌细胞因子的抗衰老功效研究

闵 倩，陈雪梅，苗 瀛，吴滌梵，徐 荻

（1.上海荟苒生物科技有限公司，上海，200333；2.上海宇研生物技术有限公司，上海，200333）

干细胞可以分泌大量的细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、干细胞生长因子（SCF）等，这些因子具有对抗氧化应激、修复创伤、调节皮肤色素代谢等作用[1-4]，同时干细胞可以通过旁分泌和细胞接触调节皮肤真皮干细胞的分化[5]，因此干细胞分泌产物具有抗衰老和美容护肤作用[6]。

机体内细胞因子的主要分泌细胞是淋巴细胞，细胞因子除了对自身细胞发挥调节作用外，还对邻近的细胞以及远处的细胞发挥旁分泌和内分泌调节作用，在促进皮肤创伤修复方面已有深入研究[7]。人体天然分泌的细胞因子已发现的达上百种，相互协同发挥作用，如表皮细胞生长因子（EGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、酸性和碱性成纤维细胞生长因子（aFGF、bFGF）、神经生长因子（NGF）等生长因子家族成员，可以定向促进各种细胞的生长，促进细胞间基质的形成，促进皮肤损伤组织的修复[8]。TGF-β转化生长因子家族，可促进成纤维细胞等组织细胞的生长，促进细胞外基质如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达[9]。基因重组细胞因子已被作为护肤添加剂使用，如重组EGF、bFGF等，但淋巴细胞分泌的天然细胞因子的皮肤抗衰老作用尚未见报道。

本研究从新生儿脐带血提取单个核细胞扩增的淋巴细胞以及健康产妇羊膜提取扩增的间充质干细胞这两种细胞中分别提取人天然分泌细胞因子，并对其中bFGF等细胞因子含量、促人成纤维细胞（HFF-1）增殖活性、促胶原蛋白合成能力等方面进行了研究和比较，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

淋巴细胞分离液（GE Health）；bFGF ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；TGF-β1 ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；IFN-γ ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；SCF ELISA检测试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）；人I型胶原ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；APCCD105流式抗体（BD Bioscience）；FITC-CD90流式抗体（BD Bioscience）；FITC-HLA-DR流式抗体（BD Bioscience）；GT-T551培养基（TaKaRa）；DMEM/F12培养基（Gibco）；IL-2（上海华新生物高技术有限公司）；Ⅳ型胶原酶（Sigma）；庆大霉素（浙江瑞新药业股份有限公司）；HFF-1细胞（中科院上海生命科学院）；1×PBS溶液（生工，配制灭菌）；通过安全性质检指标的脐带血和人羊膜（取样前与胎盘和羊水提供者签署知情同意书，知情同意书内容经医学伦理委员会认证）

1.2 实验方法

1.2.1 细胞制备（1）淋巴细胞制备：采集健康产妇的新生儿脐带血，550-600g离心10min分离出上层血浆，56℃灭活后备用。向下层沉淀中加入等体积1×PBS混匀，经人淋巴细胞分离液密度梯度离心从白膜层分离单个核细胞（PBMC），加1×PBS稀释，550g离心10min，弃上清。取PBMC细胞接种到GT-T551无血清培养基，调整细胞浓度为 1×106个/ml，添加 IL-2（200U/ml）和5%脐带血浆，在37℃、5%CO2条件下培养，不同时间收集细胞进行细胞记数，至十八天离心收集培养上清液。

（2）人羊膜间充质干细胞制备及鉴定：取健康产妇的胎盘羊膜，无菌剪剪碎，用0.05%胰酶预处理。按比例向羊膜沉淀中加入Ⅳ型胶原酶，混匀，置于水浴恒温振荡器（37℃，75r/min）2小时。待羊膜组织溶解95%以上后终止消化，100 μm细胞筛过滤，390g离心10min。取细胞接种到DMEM/F12完全培养液（含5%FBS庆大霉素50U/ml），调整细胞浓度为 5×105/ml，在37℃、5%CO2条件下培养。每隔二到三天进行细胞传代并收集第十八天的细胞培养上清。

随机抽取P0-P6代细胞进行流式鉴定，1×106个细胞加入20μL抗体，4℃孵育30 min，用1×PBS溶液洗去多余流式抗体，弃上清，再用300 μL1×PBS溶液重悬细胞，上机检测。

1.2.2 细胞因子提取将上述两种培养上清液用1KD超滤膜超滤，去除分子量1000以下的小分子杂质，收集截留液待用，标记为淋巴细胞组和间充质干细胞组。

1.2.3 Elisa检测用ELISA 试剂盒对超滤后的上清液中bFGF、TGF-β、IFN-γ、SCF以及人I型胶原蛋白含量进行定量检测，设置空白孔，标准品孔及样品孔，按试剂盒说明书依次进行上样孵育、洗板、二次孵育、洗板、显色、终止和上机检测操作。以空白孔调零，450nm波长测各孔吸光度，绘制标准曲线以计算样品中bFGF、TGF-β1、IFN-γ、SCF及人I型胶原蛋白含量。

将对数生长期的HFF-1细胞（来源于中科院上海生命科学院）用无血清培养基DMEM丙酮酸钠青链霉素混合液，调整细胞浓度为4000个/200ul，到96孔板，细胞接种量为4000个/200ul/孔，将细胞提取物按照不同浓度（0%，2%，4%，6%，8%，10%）加到各孔中，设置三复孔，加培养基后培养箱孵育72h观测，加入CCK-8溶液继续培养2 h，酶标仪测定细胞于波长450nm处的吸光度值（OD值），以0%孔为对照孔，计算细胞增殖活性增加百分率。计算公式：（OD实验孔-OD对照孔）/OD对照孔

1.2.5 统计学方法每种细胞分别用相同的方法制备三个批次的提取物，采用SPSS 19.0统计学软件进行随机单位组方差分析，两组间比较用t检验。所有数据均用（x ± s）表示，检验水准=0.05。

2 结 果

2.1 人羊膜间充质干细胞表型

P3代样品细胞高表达CD90，CD105抗体，低表达HLA-DR抗体，符合间充质干细胞的表型特征。（图1-3）

2.2 细胞因子含量

淋巴细胞提取物与间充质干细胞提取物中bFGF的 含 量 分 别 为（18.00±2.59）pg /mL和（16.48±5.04）pg /mL，无明显差异（p=0.68），TGF-β1含 量 分 别 为（19.54±3.33）pg /mL和（10.07±3.63）pg /mL，IFN-γ 含 量 分 别 为（85.43±13.08）pg /mL 和（56.61±7.66）pg /mL，统计学分析提示淋巴细胞提取物中TGF-β1与IFN-γ含量均高于干细胞提取物，二者差异有显著 性（pTGF-β1=0.029，pIFN-γ=0.034），SCF含量分别为（21.57±7.62）pg /mL和（38.56±6.08）pg /mL，干细胞提取物中SCF含量显著高于淋巴细胞提取物（p=0.043）。（图4）

2.3 人I型胶原蛋白含量

淋巴细胞及间充质干细胞提取物中人I型胶原蛋白含量分别为（37.80±4.48）pg/mL和（35.93±1.58）pg/mL，两组胶原蛋白含量无明显差异（P＞0.05）。

2.4 HFF-1细胞形态观察

显微镜下观察，未添加细胞活性提取物的人皮肤成纤维细胞：细胞数量少，缩短，两头分叉，排列紊乱，呈衰老状态（图5左）。添加淋巴细胞提取物和间充值干细胞提取物培养的人皮肤成纤维细胞，细胞形态细长，排列有序，呈生长活跃年轻态（图5 中、右）。

图1 空白对照

图2. CD90+ /CD105+率84.63%

图3. HLA-DR-率0.21%

图4 淋巴细胞及间充质干细胞提取物细胞因子含量对比图

2.5 促HFF-1 细胞增殖率

添加细胞提取物后，HFF-1细胞增长率明显提高，以2%提取物浓度为参照，当两种细胞提取物浓度从2%增加到4%时，HFF-1增殖率变化不显著（P＞0.05）。HFF-1细胞增殖率从6%开始显著上升（P ＜0.01）。淋巴细胞提取物对HFF-1细胞的促进作用略高于干细胞提取物，但两种细胞提取物对HFF-1细胞增殖的促进效果无明显差异（P＞0.05）。

3 讨 论

皮肤的老化是一个复杂的生物学过程，主要涉及真皮层，如基质金属蛋白酶水平增加导致细胞间基质（ECM）胶原蛋白和弹性纤维降解增加，TGF-1β信号传导障碍导致胶原蛋白合成减少等，此外皮下组织血管减少以及结构变化也是皮肤老化的重要因素[10,11]，因此通过补充细胞因子激活真皮层细胞活力在皮肤抗衰老领域有很大的潜力。从多种干细胞主要是间充质干细胞获得的细胞培养产物已被证实具有皮肤抗衰老功效[12,13,14]。

2013年美国哈佛大学的Loffredo[15]等科学家使用老少配的连体共生动物实验，将老年小鼠和年轻小鼠的血液进行互相交换，四周后老年小鼠肥大的心脏恢复正常。2015年斯坦福大学Wyss-Coray[16]教授团队发现在老年小鼠和年轻小鼠经手术缝合连体共生一周后两只小鼠的淋巴细胞发生了交换，淋巴细胞分泌的活性蛋白可以透过血脑屏障进入大脑，并改善老年小鼠的学习能力和睡眠。由此可见，年轻机体的淋巴细胞可以分泌具有抗衰老作用的细胞活性因子。

本实验选取新生儿脐带血和健康产妇羊膜分别提取淋巴细胞和间充质干细胞并制备细胞提取物，选择生长因子bFGF、SCF、转化因子TGF-β1、淋巴因子IFN-γ为代表性指标，测定细胞提取物中的细胞因子水平，结果显示，淋巴细胞提取物含有更高水平的TGF-β1和IFN-γ，干细胞提取物含有更高水平的SCF，二者含有相似水平的bFGF。

对体外培养的HFF-1细胞促增殖以及胶原蛋白合成检测结果证实，淋巴细胞和干细胞提取物均具有显著的促进成纤维细胞增殖和促进胶原蛋白合成能力。

图5 HFF-1未添加活性提取物培养及添加活性提取物培养形态对比图

图6 淋巴细胞及间充质干细胞促HFF-1细胞增殖率对比图

bFGF是一种多功能细胞生长因子，具有调节细胞生长和组织修复作用；干细胞生长因子SCF具有促进各种组织干细胞生长和分化作用；TGF-β1是促进皮肤胶原蛋白合成的重要信号因子；IFN-γ具有免疫调节、抗病毒和抗肿瘤作用，在皮肤病治疗领域，除用于抗病毒和细菌感染等皮肤病外，作为一种强有力的抗纤维化因子也被用于瘢痕疙瘩的治疗[17]。因此本研究提示脐带血来源的淋巴细胞与羊膜间充质干细胞相似，均能分泌丰富的细胞因子，具有显著的皮肤抗衰功效，由于其含有更高水平的TGF-β1和IFN-γ，在抑制炎症、减少瘢痕形成、修复痘印等方面具有更好的美容应用前景。

由于人体细胞分泌的天然细胞因子含量甚微，难以定量检测，本研究以bFGF、TGF-β1等细胞因子含量检测和体外培养 HFF-1细胞促增殖功能检测相结合，提供了一种细胞提取物中细胞因子的活性评估实验方法。

天然细胞分泌的活性蛋白多达数百种，这些活性成分构成复杂的细胞因子网络相互协调发挥保持机体内环境稳定以及抵御疾病的作用，虽然目前的研究还不能鉴定所有的细胞因子作用机制及其如何综合发挥抗衰老效应，但是从人体细胞获取的天然细胞因子在抗衰老领域将比单一的细胞因子有更重要的应用价值。