MicroRNA-21对肺高压血管平滑肌细胞增殖的影响

吴翔，卓书伟，郑才玲，高戈

（1.海南省中医院 检验科，海南 海口570203；2.中南大学 医学检验系，湖南 长沙 410013）

肺高压（pulmonary hypertension, PH）是一大类以肺动脉压进行性升高为特点的肺血管疾病[1]，其中肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC）增殖是肺血管重塑的关键所在[2-3]。Wnt/βcatenin信号通路在血管平滑肌细胞的功能和血管平滑肌细胞增殖中起着重要作用[4]。DKK1作为Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂，可以特异地与Wnt的受体结合，从而抑制下游信号的传导[5]。MicroRNA（miRNA）是一种新型的18～23 nt长的非编码RNA，已经在多种真核生物中证明调控miRNA表达是发育、细胞生长和分化过程中的关键参与者[6]。miRNA-21在疾病早期即呈现高表达趋势[7]，它有调节细胞增殖、侵袭和凋亡的作用，且它的表达水平与细胞的分化程度相关，能够提示患者预后[8]。本研究拟通过Wnt通路的拮抗剂DKK1探讨miRNA-21在平滑肌细胞的形成和促进平滑肌细胞的增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM细胞培养基、OPTI-MEM细胞转染培养基（Gibco）、细胞转染试剂LipofectamineTM2000、实时荧光定量PCR试剂盒、miRNA-21引物、内参（Ambion），相关抗体购自Abcam公司，大鼠肺血管平滑肌细胞（原代分离）。

1.2 细胞培养与转染

野百合碱干预喂养大鼠复制PH动物模型，取模型肺动脉组织剪碎消化，贴壁培养，获得肺高压大鼠PASMCs[9]，于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中37℃、5%二氧化碳CO2条件下培养，每2天换液，3～4 d传代1次。

miRNA-21 mimics和对照序列自行设计交生工生物工程上海(股份)有限公司合成。实验分3组：miRNA-21抑 制 组、miRNA-21正 常 组和miRNA-21过表达组。miRNA-21引物序列：正向5'-AGGCTGTGAAGCTCTCCCCACT-3'，反向5'-G CCACACTGCTGCCTTTTAGTCCC-3'。GADPH探针序列：正向5'-ACGCCTCTGGCCGTACCACT-3'，反向5'-TGGTGAAGCTGTAGCCGCGC-3'。进行瞬时转染，细胞存活率＜50%。

1.3 实时荧光定量PCR

按照逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转为cDNA，样本置入-20℃冰箱冷冻保存。按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应。

1.3.1 miRNA-21表达水平检测 PH大鼠模型原代PASMCs瞬时转染miRNA-21 inhabits 和overpress mimics 48 h后，实时荧光定量PCR分别检测3组细胞中miRNA-21表达水平。

1.3.2 β-catenin、Cyclin D1和 DDK1核酸表达水平检测 外源性miRNA-21干扰PH大鼠模型原代PASMCs后，实时荧光定量PCR法分别检测3组细胞Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和DDK1的核酸表达水平。

1.4 Western blot检测 β-catenin、Cyclin D1、DKK1蛋白表达

一抗浓度1∶1 000，β-actin：一抗浓度1∶1 000。收集瞬时转染后72 h细胞，提取总蛋白。SDS-PAGE分离蛋白质，转膜．室温封闭，一抗4℃反应过夜，洗膜，二抗室温孵育1 h，洗膜，增强发光底物试剂反应发光，X射线片显影。

外源性miRNA-21干扰PH鼠模型原代PASMCs后，Western blot法分别检测3组细胞Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和DKK1的蛋白表达水平，阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其累积光密度（integrated optical density, IOD）参考值，其发表强度用β-catenin、Cyclin D1或者DKK1光密度值/β-action光密度值表示，重复6次，统计结果。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代大鼠PASMCs瞬时转染后miRNA-21表达的改变

miRNA-21的 表 达，miRNA-21正 常 组 为（0.000407±0.000184），miRNA-21抑 制 组 为（0.000038±0.000013），miRNA-21过 表 达 组 为（0.0414±0.0012），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=68.32，P=0.000）。其中，与miRNA-21正常组比较，miRNA-21抑制剂组原代大鼠PASMCs中miRNA-21表达下降（P＜0.05），而miRNA-21过表达组原代大鼠PASMCs中miRNA-21表达增高（P＜0.05）。

2.2 外源性miRNA-21对Wnt通路中βcatenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表达的影响

各组细胞中β-atenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表达，经单因素方差分析，差异有统计学意义（均P＜0.05）。其中在外源性miRNA-21被抑制的时候，PH大鼠模型原代PASMCs中β-catenin、Cyclin D1的mRNA表达水平增高（均P＜0.05），DDK1的miRNA表达水平降低（P＜0.05）；而在外源性miRNA-21过表达干预的时候，细胞中β-catenin、Cyclin D1的mRNA表达水平反而降低（均P＜0.05），DDK1 mRNA表达水平增高（P＜0.05）。见表1。

表1 外源性miRNA-21对β-catenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表达的影响 （n =6，±s）

表1 外源性miRNA-21对β-catenin、Cyclin D1和DDK1 mRNA表达的影响 （n =6，±s）

注：†与miRNA-21组比较，P ＜0.05

miRNA-21 正常组 0.000 867±0.000 256 0.003 469±0.001 022 0.000 813 7±0.000 368 6 miRNA-21 抑制组 0.002 769±0.000 879† 0.011 08±0.003 517† 0.000 075 5±0.000 022 6†miRNA-21 过表达组 0.000 200 9±0.000 078† 0.000 401 7±0.000 156† 0.010 37±0.003 057†F值 37.867 40.464 62.627

2.3 外源性miRNA-21对Wnt通路中β-catenin、Cyclin D1和DDK1蛋白表达的影响

各组细胞β-catenin、Cyclin D1和DDK1蛋白表达，经单因素方差分析，差异有统计学意义（均P＜0.05）。其中，在外源性miRNA-21被抑制的时候，PH大鼠模型原代PASMCs中β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达水平增高（均P＜0.05），DDK1的蛋白表达水平降低（P＜0.05）；而在外源性miRNA-21过表达干预的时候，细胞中β-catenin、Cyclin D1的蛋白表达水平降低（P＜0.05），DDK1的蛋白表达水平增高（P＜0.05），与基因表达一致。见附图和表2。

表2 外源性microRNA-21对β-catenin、cyclin D1和DDK1蛋白表达的影响 （n =3，±s）

表2 外源性microRNA-21对β-catenin、cyclin D1和DDK1蛋白表达的影响 （n =3，±s）

注：†与miRNA-21正常组比较，P ＜0.05

组别 β-catenin蛋白 cyclin D1蛋白 DDK1蛋白miRNA-21 正常组 0.418 1±0.017 42 0.320 3±0.019 25 0.300 3±0.030 7 miRNA-21抑制组 0.860 9±0.090 11† 0.717 2±0.045 32† 0.190 3±0.032 64†miRNA-21过表达组 0.220 5±0.030 04† 0.176 6±0.253 5† 0.769 8±0.090 19†F值 103.818 230.183 84.055 P值 0.000 0.000 0.000

附图 外源性miRNA-21对β-catenin、Cyclin D1和DDK1蛋白表达的影响 （n =3）

3 讨论

早期预测高度保守的基因类型的miRNA不仅扩大人类对该疾病的生物学理解，更重要的是开辟新的发展途径新的预后和诊断策略[10]。由于miRNA稳定性高，即使在保存不良的标本中，也被认为是强大的临床分析物，对临床研究和生物标志物发现很有价值。miRNA-21以前多报道见于人类癌细胞系，miRNA-21扮演着癌基因的角色，有调节细胞增殖、侵袭和凋亡的作用[11-13]，而在PH的发病机制中，肺血管收缩、肺血管重塑和肺血管原位血栓形成是PH发生、发展的3个重要病理生理基础，其主要病理特征为肺血管重构。主要表现为PASMCs增殖，肌型血管中膜增厚，非肌型血管肌化，成纤维细胞和胞外基质合成增多等[2]。PASMCs增殖是肺血管重塑的关键所在，亦是阻止和逆转肺高压进程的关键所在，本研究认为，miRNA-21在PH早期通过对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响，也参与肺血管的重塑。

而在不同的Wnt信号途径中，DKK仅特异地影响经典Wnt信号通路，而对于Wnt/PCP通路及Wnt/Ca2+通路无明显的作用。在DKK家族中，DKK1作为Wnt通路的抑制子是研究得较清楚的。DKK1作为Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂，可以特异地与Wnt的受体之一LRP5/6结合，从而干扰LRP5/6与Wnt-Frizzled复合物的结合，抑制下游信号的传导。当在野百合碱诱导的大鼠PH模型中使用DKK1抗体后可降低平滑肌细胞的增殖。这表明通过阻断Wnt通路的拮抗剂DKK1对平滑肌细胞的形成和促进平滑肌细胞的增殖都具有重要意义。

本实验结果证实，在外源性miRNA-21干扰PH大鼠模型原代PASMCs后，PH大鼠模型原代PASMCs中β-catenin、Cyclin D1和DDK1的表达水平随之改变。在外源性miRNA-21被抑制的时候，PASMCs中β-catenin、Cyclin D1表达水平增高，DDK1表达降低，拮抗作用减弱；而在外源性miRNA-21过表达干预的时候，PASMCs中β-catenin、Cyclin D1表达水平降低，DDK1表达增高，拮抗作用增强。所以笔者认为miRNA-21的早期干预可通过调控Wnt通路的DKK1作用与Wnt/β-catenin信号通路，Wnt/β-catenin信号通路在血管平滑肌细胞的功能和血管平滑肌细胞增殖中起着重要作用，Wnt蛋白通过与膜上受体LRP5/6及frizzed（Fz）结合形成的跨膜复合物导致细胞内信号通路活化，激活的受体将信号进一步传递到细胞质中，使得Dishevelled和Axin被募集到细胞膜上，导致Axin-APC-GSK3β复合物被破坏，于是β-catenin从这个降解复合体中释放出来并在细胞质中积累。胞质中积累的β-catenin继而进入细胞核与LEF/TCF等转录因子结合，激活下游靶基因的转录，从而促进血管平滑肌细胞增殖。miRNA-21有望成为早期检测PH的新靶点。