胎盘间充质干细胞移植对类风湿关节炎大鼠炎症因子及软骨破坏的影响

蒋文捷，梁雪梅

（西南医科大学附属医院 老年科，四川 泸州 646000）

类风湿关节炎是一种可由多因素引发的自身免疫性疾病，病变主要累积关节，病理表现为成纤维样滑膜细胞增生、大量炎症细胞浸润、微血管新生、血管翳形成及软骨和骨组织的破坏等，好发于40～60岁年龄段，且以女性居多，其发病持续时间与关节炎症程度呈正相关，应给予及早发现治疗，避免发生关节畸形及功能丧失。目前，对类风湿关节炎的治疗，主要是减轻关节炎症反应，抑制病变发展及不可逆骨质破坏，尽可能保护关节和肌肉功能，最终达到病情完全缓解或低疾病活动度的目的[1-3]。治疗药物主要有非类固醇类消炎止痛药，如芬必得、扶他林等，可减轻症状，但不能治根；缓解病情药，如按捺剂等，能缓解病情；激素，可快速消除症状，但不良反应严重。也陆续有一些新的药物被用于治疗类风湿关节炎，但还是有很大一部分患者病情得不到控制，因此迫切需要一种更好的治疗方法。

间充质干细胞来源于中胚层，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，来源广泛，体外容易扩增，安全性较好，免疫原性低，并且具有强大的免疫抑制功能。间充质干细胞来源广泛，可来源于骨髓、脂肪、脐带、脐血或胎盘等多种组织，并且有研究证实间充质干细胞可抑制成纤维样滑膜细胞的增殖[4-5]。实验选择人胎盘间充质干细胞（placenta mesenchymal stem cells, PMSCs）作为移植治疗细胞，观察其对类风湿关节炎大鼠炎症因子及软骨破坏的改善作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人胎盘组织来自本院实施剖宫产产妇，产妇健康，产妇自愿捐献胎盘组织，对实验知情同意并签署知情同意书。鼠成纤维细胞购自上海富衡生物科技有限公司。

6～8周龄清洁级SD大鼠32只，雌雄不拘，体重（200±16）g，将35只大鼠随机分为正常组（n=8）、模型组（n=8）、对照组（n=8）及实验组（n=8）。

Ⅰ型胶原酶、牛Ⅱ型胶原、弗氏完全佐剂（美国Sigma Alofich公司），逆转录酶试剂盒（大连TaKaRa公司），DMEM培养基、成脂诱导培养基及成骨诱导培养基（Gibco公司），抗CD90、CD44、CD34、CD45抗体（美国BD公司），茜素红S试剂、油红O试剂（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 仪器与设备

流式细胞仪（美国BD公司），倒置相差显微镜（日本Olympus公司），酶标仪（美国Molecular Devices公司），二氧化碳CO2培养箱（美国Forma公司），PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 PMSCs的分离培养[6-7]取新鲜剥离胎盘羊膜下组织，PBS反复清洗后，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，Ⅰ型胶原酶水浴震荡消化1 h，细胞筛过滤收集，离心弃上清，PBS清洗2遍后，以含胎牛血清、双抗的DMEM培养基培养，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中，72 h后全量换液，每3天换液1次，第4、5天细胞生长可达80%融合，胰酶消化细胞，以1∶3的比例进行细胞传代，传代培养第3代细胞用于以下实验。

1.3.2 PMSCs的鉴定 取第3代PMSCs，流式细胞仪检测细胞表面CD90、CD44、CD34、CD45抗体表达；取生长良好的第3代PMSCs，细胞生长至80%融合时接种至6孔板，加入成脂细胞诱导培养液培养10 d，进行油红O染色，观察脂滴形成情况[8]；取生长良好的第3代PMSCs，细胞生长至80%融合时接种至6孔板，加入成骨细胞诱导培养液培养21 d，进行茜素红染色，观察钙结节形成情况[8]。

1.3.3 复制类风湿性关节炎动物模型 首先将纯化的牛Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L醋酸中，制成质量浓度为1 g/L的溶液，与等量弗氏完全佐剂混合成稳定乳剂。取模型组、对照组及实验组大鼠，在各大鼠背部皮内分4点共注射1 ml乳剂；21 d后，将0.5 mg胶原溶于0.5 ml 1 mol/L醋酸中，注入大鼠腹腔再次加强注射。第1次注射后2周，随机取模型组大鼠3只，处死，取后肢关节进行苏木精-伊红染色，发现关节腔均存在不同程度狭窄，关节软骨增生严重，部分个体标本可见软骨坏死现象，滑膜组织增生较多，可见10层以上的细胞层，关节周边可见增生较多的血管丛或血管翳，证实实验造模成功[9]。

1.3.4 实验分组干预 第2次注射后12 h，实验组大鼠尾静脉注射1×107个/kg PMSCs（细胞浓度为1×107个/ml），对照组注射等量成纤维细胞，模型组不进行任何治疗。干预3周后，处死所有大鼠，进行以下检测。

1.3.5 酶联免疫吸附实验检测细胞因子水平 处死前内眦静脉取外周血2 ml，1 000 r/min离心10 min，取上清液，严格参照酶联免疫吸附试剂盒说明书操作，检测肿瘤坏死因子ɑ（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、白细胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）及白细胞介素6（interleukin-6, IL-6）水平。

1.3.6 检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）、基质金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metallo-proteinases, TIMPs）及钙黏素11 mRNA表达处死大鼠，获取关节滑膜组织，提取各组RNA，按逆转录试剂盒说明书操作获得cDNA，设计引物序列。MMP-1：正向 5'-CTGGCCAAATCTGCCAGGTAA-3'，反 向 5'-TCACAAACGGCAGCGTCAA-3'；MMP-3：正向5'-TGATGGGCCTGGAATGGTC-3'，反向5'-TTCAT GAGCAGCAACCAGGAATAG-3'；MMP-13：正向 5'-CC CAGATGATGACGTTCAAGGA-3'，反向 5'-CTCGGAGA CTAGTAATGGCATCAAG-3'；TIMP-1：正向 5'-CATCT CTGGCCTCTGGCATC-3'，反向 5'-CATAACGCTGGTAT AAGGTGGTCTC-3'；TIMP-3：正向5'-AGGGCTGTGC AACTTTGTGG-3'，反向5'-TCTTGGAGGTCACAAAGC AAGG-3'；钙黏素11：正向5'-TGCTGCCAACAGCCCA ATAA-3'，反向5'-GAGATGTTGAGCCAGGCAGTTTC-3'；GADPH：正向 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反 向 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR 反 应总体积20 μl，在ABI Prism 7500型高通量荧光定量PCR仪进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR），各基因每个标本做3个复孔，qRT-PCR反应条件：95℃预变性10 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，循环45次；在60℃退火34 s阶段检测荧光值，并在上述扩增条件后增加60～95℃的熔解曲线分析步骤，计算各标本平均Ct值，以GAPDH Ct值作为内参，将目的基因Ct值减去GAPDH Ct值作为ΔCt值。正常组大鼠的ΔCt值平均值作为ΔΔCt值，计算标准化后的2-ΔΔCt值为mRNA的相对表达含量[10]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，符合正态分布和方差齐性的情况下，多组间数据比较可采用多个样本均数比较的方差分析，差异有统计学意义，再进一步应用LSD-t检验进行组间两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PMSCs的分离培养与鉴定结果

原代培养约3 d，可见少量贴壁细胞，细胞呈圆形或梭形；培养10 d左右，贴壁细胞逐渐增多并伸展；培养的第3代PMSCs呈长梭形，类似成纤维细胞，呈漩涡状聚集（见图1A）。第3代PMSCs成脂诱导培养10 d后，油红O染色可见红色的脂滴颗粒，呈阳性（见图1B）；成骨诱导培养21 d后，茜素红染色可见钙结节，呈阳性（见图1C）。流式细胞仪检测显示，第3代PMSCs高表达CD44、CD90，而CD34、CD45呈阴性表达（见图2）。

2.2 4组细胞因子水平比较

方差分析结果表明，4组间TNF-α、TGF-β、IL-1β及IL-6水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步进行LSD-t检验结果表明，模型组、对照组与正常组比较，TNF-α、IL-1β及IL-6水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组与模型组、对照组比较，TNF-α、IL-1β及IL-6水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组TGF-β水平高于其余3组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图1 PMSCs的培养与成脂成骨分化能力 （×100）

图2 PMSCs表面分子表达分析

表1 各组大鼠血清细胞因子水平的比较 （n =8，ng/L，±s）

表1 各组大鼠血清细胞因子水平的比较 （n =8，ng/L，±s）

注：1）与正常组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05；3）与对照组比较，P ＜0.05

组别 TNF-α TGF-β IL-1β IL-6正常组 57.65±11.23 309.79±96.45 25.67±8.96 25.68±8.96模型组 80.12±9.681） 310.57±198.60 99.36±89.781） 89.85±24.381）对照组 70.69±6.391） 246.27±80.961） 66.38±28.541） 88.64±25.641）实验组 58.62±10.782）3） 512.63±230.192）3） 59.35±26.782）3） 70.69±11.852）3）F值 32.092 43.465 59.474 48.954 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 4组MMPs mRNA表达比较

方差分析结果表明，4组间MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步进行LSD-t检验结果表明，模型组、对照组与正常组比较，滑膜组织MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组与对照组、模型组比较，MMP-1、MMP-3及MMP-13 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

2.4 4组TIMP-1 mRNA表达比较

正常组、模型组、对照组、实验组TIMP-1 mRNA表达分别为（4.90±0.45）、（1.39±0.21）、（8.09±0.78）及（10.26±0.90）。正常组、模型组、对照组、实验组TIMP-3 mRNA表达分别为（1.29±0.15）、（0.49±0.08）、（0.36±0.06） 及（0.52±0.09）。 方 差 分 析结果表明，4组间TIMP-1、TIMP-3 mRNA表达比较，差异有统计学意义（F=25.145和22.466，均P=0.000）。进一步进行LSD-t检验结果表明，模型组与正常组比较，TIMP-1、TIMP-3 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组、实验组与模型组比较，TIMP-1 mRNA表达增高，差异有统计学意义（P＜0.05），而模型组、对照组、实验组间TIMP-3 mRNA表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 4组钙黏素11 mRNA表达比较

正常组、模型组、对照组、实验组钙黏素11 mRNA 表达分别为（0.94±0.08）、（5.92±0.64）、（6.15±0.59）及（0.82±0.05）。方差分析结果表明，4组间钙黏素11 mRNA表达比较，差异有统计学意义（F=20.893，P=0.000）。进一步进行LSD-t检验结果表明，模型组、对照组与正常组比较，钙黏素11 mRNA表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组与模型组、对照组比较，钙黏素11 mRNA表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组大鼠滑膜组织MMPs mRNA表达的比较（n =8，±s）

表2 各组大鼠滑膜组织MMPs mRNA表达的比较（n =8，±s）

注：1）与正常组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05；3）与对照组比较，P ＜0.05

组别 MMP-1 mRNA MMP-3 mRNA MMP-13 mRNA正常组 1.23±1.12 1.35±1.24 1.49±1.89模型组 6.80±5.691） 5.89±6.971） 22.58±19.491）对照组 8.54±5.981） 6.01±4.211） 23.19±23.251）实验组 1.19±1.252）3） 1.33±1.262）3） 3.01±2.152）3）F值 21.628 23.440 29.151 P值 0.000 0.000 0.000

3 讨论

体内外研究表明，间充质干细胞具有免疫抑制能力，可通过调节淋巴细胞亚群而改善系统性红斑狼疮与克罗恩病[11-12]。因此推测PMSCs也同样有免疫抑制能力，并且前期实验通过病理组织学也证实，PMSCs确实可改善类风湿关节炎模型大鼠的关节炎症及关节破坏的程度。因此本实验做了进一步研究，观察PMSCs移植治疗后，大鼠血清炎症因子及滑膜组织MMPs、TIMPs及钙黏素11的表达水平。

IL-1β、IL-6与TNF-α均是类风湿关节炎发病的重要促炎症因子，参与疾病的发生与发展[13-16]。解海霞等[17]、肖金鱼等[18]研究表明，白细胞介素1可促进滑膜细胞和淋巴细胞的增殖和分化，促进滑膜细胞和软骨细胞合成并释放前列腺素E2和D胶原酶，引发滑膜炎症反应、软骨基质的崩解。另外，IL-1β能刺激滑膜细胞和软骨细胞合成过量的MMPs，包括胶原酶和基质溶素，后者能溶解破坏软骨基质。在体外，TNF-α可刺激滑膜纤维母细胞和软骨细胞产生前列腺素E2和胶原酶，促进骨质破坏和骨的吸收及纤维母细胞增生，抑制骨胶原的合成；也能促进软骨细胞分泌纤维蛋白溶酶激活剂，使纤维蛋白溶酶原变成纤维蛋白溶酶，加快关节炎损伤过程。IL-6可由IL-1β、TNF-α诱导与分泌，其与IL-1β与TNF-α具有协同效应。通过检测3种细胞因子水平，可判断PMSCs对类风湿关节炎的炎症抑制作用。研究结果显示，模型组、对照组TNF-α、IL-1β及IL-6水平均高于正常组，说明实验造模成功，有关节炎症表现；实验组TNF-α、IL-1β及IL-6水平低于模型组及对照组，说明PMSCs移植治疗降低类风湿性关节炎的炎症反应，具有治疗作用。此外，实验结果还显示实验组TGF-β水平高于其余各组，而TGF-β为抑炎症因子，同样也证实了PMSCs的治疗作用。

类风湿关节炎最重要的病理表现之一就是软骨的破坏，而软骨破坏主要与MMPs及TIMPs比例失衡及钙黏素的表达有关[19-22]。实验结果显示，类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织内高表达破坏软骨结构的MMP-1、MMP-3及MMP-13，低表达TIMP-1、TIMP-3经过PMSCs移植治疗后，滑膜组织内MMP-1、MMP-3及MMP-13降低，说明其可通过抑制MMPs的表达减轻关节软骨的破坏。钙黏素11为关节滑膜细胞特异性表达黏附分子，可促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的迁移，增强其侵袭能力，参与类风湿关节炎的发生、发展。本研究结果显示，模型组、对照组钙黏素11水平高于正常组，差异有统计学意义，证实类风湿关节炎发病中滑膜组织钙黏素11水平增高；经过PMSCs移植治疗后，类风湿关节炎模型大鼠滑膜组织钙黏素水平降低，说明PMSCs移植可通过下调类风湿关节炎滑膜组织钙黏素11水平来抑制滑膜成纤维细胞的迁移，抑制其侵袭能力，阻止病情的进一步发展。

综上所述，PMSCs可能通过抑制TNF-α、IL-1β及IL-6水平及MMPs分泌与钙黏素11表达，上调TGF-β水平，来减轻类风湿关节炎大鼠的关节炎症与软骨破坏，但具体的机制还有待进一步研究。