2，4-二氯苯氧乙酸作用的鼠乳对幼鼠蓝斑核中多巴胺β-羟化酶表达的影响*

李京，毛庆花，秦燕霞

（1.山东省济宁医学院基础医学院，山东 济宁 272067；2.山东省济宁市第一人民医院 新生儿科，山东 济宁 272000）

在现代社会，越来越多的环境污染物严重威胁人类的健康。研究显示[1]，如果女性处于化学污染物不断增多的工作和生活环境下，该女性体内的化学物质将不断积聚，在其产后的乳汁中，不仅能够检测出该化学物质，还可能通过哺乳的方式进入新生儿体内，导致新生儿自出生后便遭受污染物的损害[1]。

在大鼠出生后的2周内，中枢神经系统神经元的轴突及树突呈外向生长，突触之间联系不断发生，称为脑的急剧生长。在发育过程中，中枢神经系统对外环境的敏感性不断加强；当外界环境恶化时，神经递质系统可能表现异常，甚至引起不可逆性损害。多巴胺β-羟化酶（dopamine-beta-hydroxylase,DBH）是催化多巴胺（dopamine）合成去甲肾上腺素（noradrenaline, NA）的标志酶[2]。研究表明，将含有除草剂2, 4-二氯苯氧乙酸（简称2, 4-D）的乳汁喂养乳鼠后，发现其脑内多巴胺递质系统改变明显，在黑质和中脑腹侧被盖区，多巴胺神经元内酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的活性降低，5-羟色胺神经纤维的密度减少，并伴随行为活动改变[2]。然而，2, 4-D对于脑内去甲肾上腺素递质系统的作用并不清楚。本研究将新生鼠置于2,4-D暴露的环境中，观察其蓝斑核DBH表达的变化情况，并进一步阐述2, 4-D对神经系统发育的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

新生Wistar鼠30只及其母鼠购于济宁医学院实验动物中心（批文号：SCxK晋20080001），兔抗鼠DBH单克隆抗体购于Sigma公司，免疫组织化学（简称免疫组化）试剂盒购于北京中杉金桥公司，2，4-D（批号：94-75-7）购于青岛捷世康生物科技公司，二甲亚砜（DMSO批号：67-68-5）购于南京化学试剂有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 将生后1 d的30只幼鼠分成3组，每组10只，并将相对应的母鼠置于同一饲养箱，温度控制在22～24℃，保持饲养箱卫生、通风状况良好，优质饮食喂养母鼠，对幼鼠哺乳。自幼鼠生后第8天开始，实验组1：向母鼠腹腔每天注射2，4-D 70 mg/kg+0.1 ml DMSO；实验组2：2，4-D 100 mg/kg+0.1 ml DMSO；对照组：母鼠对幼鼠进行哺乳；直至生后第21天，测量幼鼠的体重。第22天处死幼鼠，测量脑重量；取蓝斑区脑组织进行切片、备用。

1.2.2 免疫组化染色 采用试剂盒说明书的步骤，即ABC法进行操作。

1.2.3 相对光密度值测定 采用图像分析软件检测蓝斑核DBH阳性区域的平均灰度值，相对光密度=Log（256/平均灰度）。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

幼鼠生后第22天，与对照组比较，实验组1体重及脑重减少均不明显；而实验组2体重与脑重减少，均低于对照组和实验1组。见表1。

与对照组比较，两实验组幼鼠的蓝斑核DBH免疫反应降低（见附图）；实验组1与实验组2 DBH相对光密度值比较，差异无统计学意义（P=0.312）；与对照组比较，实验组 1（P=0.000）、实验组 2（P=0.000）DBH相对光密度值均降低（见表2）。

表1 生后第22天，3组幼鼠体重及脑重比较（n =10，±s）

表1 生后第22天，3组幼鼠体重及脑重比较（n =10，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与实验组1比较，P ＜0.05

组别 体重/g 脑重/g对照组 47.21±2.90 1.33±0.04实验组1 45.09±3.27 1.31±0.05实验组 2 35.60±2.841）2） 1.16±0.051）2）F值 42.180 37.863

表2 生后第22天，3组幼鼠蓝斑核相对光密度值比较（n =10，±s）

表2 生后第22天，3组幼鼠蓝斑核相对光密度值比较（n =10，±s）

注：†与对照组比较，P ＜0.05

组别 相对光密度值对照组 0.88±0.38实验组1 0.21±0.03†实验组2 0.19±0.02†F值 615.622 P值 0.000

附图 幼鼠蓝斑核DBH表达 （×40）

3 讨论

既往于DBH的研究，主要集中在机体的应激状态下，DBH、NA对于生理活动、运动的调节等方面。例如，在大鼠疼痛模型研究中[3]，发现脊髓的前角、外侧角内DBH阳性神经元数量增多，DBH受到上游因子AP-2α的调控，AP-2αmRNA水平增高，AP-2α蛋白合成升高，便引起DBH阳性产物增加；然而它没有对脑蓝斑区的DBH进行检测，脊髓内增加的DBH，既可能是蓝斑区合成DBH增多进而转运到脊髓，也有可能是其他性质的神经元发生转化的结果。本实验从幼鼠摄入2，4-D 慢性中毒 的模型入手，发现实验组的幼鼠体重、脑重均随着中毒时间的延长而落后于对照组。说明2，4-D不仅严重影响脑的生长活动，也会引发全身各器官、系统的发育滞后。

除草剂是被广泛使用的化学制剂，在减少杂草、提高农作物产量方面起到重要作用；与此同时，也对土壤结构、土质造成一定损害。2，4-D属于激素型除草剂，被叶片吸收后，转运至植物的分生组织，导致茎干卷曲、叶片萎蔫，造成植物的死亡，是一种高效内吸性除草剂[4]。DMSO是一种含硫有机化合物，对人体无毒，在研究中常常作为药物的溶剂，用来加快药物的吸收。本实验未设置单独注射DMSO的研究组，是因为DMSO没有神经系统毒性。

研究表明[5]，中缝背核内5-羟色胺核团与蓝斑NA核团具有密切关联，从中缝背核至蓝斑核的纤维投射十分密集，该投射具有重要功能：如调节睡眠-觉醒状态，维持机体警觉，调整认知变化及应激反应等。当蓝斑核遭受毒性刺激时，中缝背核能够产生抑制性效应。中缝背核所含的5-羟色胺神经元，通过其神经终末释放5-羟色胺，调节蓝斑区DBH的浓度，控制NA的合成。

在2，4-D暴露下的幼鼠，STÜRTZ等[6]发现，中脑的5-羟色胺神经元免疫活性增强，同时伴有其代谢产物5-羟吲哚乙酸的含量升高；而黑质内多巴胺能神经元TH免疫活性降低，也是受5-羟色胺调节的结果[7]；说明机体受到毒物侵害时，5-羟色胺神经元通过自身或间接调节其他脑区神经递质的变化，将损害降至最小。本研究在2个实验组的蓝斑核，发现DBH的表达降低，2个剂量组产生的效果相接近，提示当2，4-D使用剂量为70 mg/kg时，脑内部结构已经严重受损；可能此时的机体处于代偿状态，其体重、脑重并未无改变；随着2，4-D剂量的增加，不仅脑蓝斑区受损加剧，伴随各系统代偿失衡，甚至器官功能衰竭。最新的研究显示[8]，蓝斑核及其位于被盖网状核、内侧前额叶皮质、脊髓后角的神经纤维末梢，参与神经损伤后导致的触痛及痛觉过敏等症状。在损伤-康复过程中，蓝斑核先是发挥抑制疼痛的作用，而后又使得疼痛加剧[9]。

综上所述，由于蓝斑区TH的水平受到5-羟色胺的负性调节，即5-羟色胺的浓度升高，TH的合成会减少，导致络氨酸转化生成多巴胺的量降低，最终合成NA的含量也减少。另一方面，升高的5-羟色胺通过纤维投射直接抑制DBH的活性，造成NA的合成减少。机体处在NA含量很低状态下，其健康受到严重威胁，甚至连正常的生理活动都无法完成。如果新生儿摄入含有2，4-D的乳汁或乳制品，必然危害其发育。因此，在农牧业领域，减少化学制剂的使用，不仅能够改善生态环境，更有利于提高农作物品质，促进健康发展。