响应面法优化大白菜腌制条件

褚路路,杨丽聪,郑国栋

(江西农业大学江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西南昌 330045)

众所周知,蔬菜中富含丰富的维生素、矿物质、纤维素等人体不可缺少的营养成分,是人类餐桌上必不可少的一种食物。伴随而来是多种蔬菜加工方式的出现,其中,蔬菜腌制是中国应用最普遍、最古老的蔬菜加工方法,是一种将新鲜蔬菜经预处理后,利用高浓度盐液、乳酸菌发酵来保藏蔬菜,并通过腌制增进蔬菜风味以赋予其新鲜滋味的方法[1],发酵蔬菜、泡菜、榨菜等都属于腌制蔬菜的范畴。

蔬菜在生长过程中易富集硝酸盐,在腌制过程中,腌制蔬菜易被杂菌污染,如果加入食盐量少于10%,蔬菜中的硝酸盐极易被微生物还原成亚硝酸盐[2-4]。随着腌制时间的增加,腌制蔬菜中亚硝酸盐的含量不断增加,一周后可达到高峰,甚至可持续2～3周,20 d后亚硝酸盐含量会逐渐下降,达到安全食用标准。亚硝酸盐毒性较强,人体食用0.2～0.5 g亚硝酸盐或硝酸盐就会引起中毒[5-6],使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白,失去携氧能力而引起组织局部缺氧造成缺氧损伤。硝酸盐不但可导致高铁血红蛋白症,还会与食物中的蛋白质发生反应而生成强致癌物质—亚硝胺。亚硝酸盐与胺类或酰胺类同时存在,孕妇过量摄入可能造成胎儿致癌、畸形、甚至死亡[7]。因此腌制蔬菜中亚硝酸盐含量测定是食品卫生检验的必测项目之一。

传统腌制方法只能通过规范腌制天数来和接种发酵[8]来降低亚硝酸盐的含量,本实验综合考虑发酵条件和添加物[9]对腌制大白菜中亚硝酸盐含量生成的影响。本文以腌制大白菜中亚硝酸盐的含量变化动态过程为实验基础,采用国标法(GB/T 5009.33)—盐酸萘乙二胺法,探究了维生素C加入量、食用醋酸加入量、腌制时间三个因素对腌制大白菜中亚硝酸盐含量的影响,通过响应面优化寻求最佳的腌制条件和辅料比例,旨在减轻腌制菜中亚硝酸盐含量过高对食用者的威胁,同时为更深入探究其它腌制菜中的亚硝酸盐含量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料大白菜(生长在南昌郊区蔬菜基地,品种为超级白菜,青白帮,花心直筒型,)、食盐等 南昌批发超市;食用醋酸(含量≥99.5%) 济南鸿桥化工有限公司;维生素C、活性炭、饱和硼砂溶液、乙酸锌、格氏粉剂 天津风船化学试剂科技有限公司;亚铁氰化钾、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺 国药集团化学试剂有限公司;以上所有化学试剂均为分析纯。

TU-1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;YP202电子天平 上海富雪生物科技有限公司;GPX-9248A保温箱 上海跃进医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 腌制方法 取200 g清洗后的大白菜,切碎后放入腌制坛中,在加入10%食盐的基础上,分别加入不同浓度的维生素C和食用醋酸,并搅拌均匀,最后封坛,在25 ℃条件下腌制30 d。

1.2.2 腌制过程亚硝酸盐含量的变化 取200 g处理干净的大白菜,加入食盐10%,作为空白对照组在25 ℃条件下进行腌制,分别测定第2、4、6、8、10、15、20、25、30 d时测腌制大白菜中的亚硝酸盐含量。

1.2.3 亚硝酸盐含量的测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 将亚硝酸钠标准品溶液稀释至10 mg/L,4 ℃保存备用。准确量取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL的亚硝酸钠标准品溶液(10 mg/L),加入2 mL对氨基苯磺酸溶液,混合均匀,静置5 min再加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液,加水稀释至50 mL,混匀,静置15 min,样品液通过分光光度计在波长538 nm处测定吸光度值,以亚硝酸钠含量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线[10-12]。

1.2.3.2 腌制大白菜中亚硝酸盐含量的测定 取一定量的腌制大白菜切成小块,混匀,称取200 g,将试样置于榨汁机内,加蒸馏水200 mL,打成匀浆状后全部移入 500 mL烧杯中备用。称取匀浆40 g置50 mL烧杯中,用70 ℃的蒸馏水约150 mL分几次将其冲洗入250 mL容量瓶中,加入6 mL饱和硼砂溶液并摇匀,加入2 g活性炭脱色,然后再加入2 mL乙酸锌溶液和2 mL亚铁氰化钾溶液振摇4 min,以沉淀蛋白质。加水稀释至刻度,摇匀,用真空泵过滤,滤液用于测定。吸取5.0 mL制备好的滤液于10 mL比色管中,加入 40 mg格氏粉剂,混匀,如未溶解可加热使溶解,放置5 min后,于波长538 nm处测定吸光度,样品每组平行测三次,记录吸光值,带入标准曲线中计算出腌制蔬菜中亚硝酸盐的含量。

式中：X为试样中亚硝酸盐的含量,单位为毫克每千克(mg/kg);A为测定用样液中亚硝酸盐的质量,单位为微克(μg);M为试样质量,单位为克(g);V2为测定用样液体积,单位为毫升(mL);V1为试样处理液总体积,单位为毫升(mL)。

1.2.4 单因素试验

1.2.4.1 维生素浓度对腌菜中亚硝酸盐的影响 取200 g处理干净的大白菜,加入食盐10%,食用醋酸10%进行腌制,腌制过程中加入不同量的维生素C 0、0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%,25 ℃下在腌制25 d,测定亚硝酸盐的含量,探究维生素C对亚硝酸盐含量的影响。

1.2.4.2 食用醋酸浓度对腌菜中亚硝酸盐的影响 取200 g处理干净的大白菜,加入食盐10%,维生素C 0.2%,腌制过程中加入不同量的食用醋酸0、4%、6%、8%、10%、12%、14%,25 ℃下在腌制25 d,测定亚硝酸盐的含量,探究食用醋酸含量对亚硝酸盐含量的影响。

1.2.4.3 温度对腌菜中亚硝酸盐的影响 取200 g处理干净的大白菜,加入食盐10%,维生素C 0.2%,食用醋酸10%,分别在20、25、30、35、40、50 ℃温度条件下腌制25 d,测定亚硝酸盐的含量,探究温度对亚硝酸盐含量的影响。

1.2.5 响应面实验 通过对影响腌制大白菜中亚硝酸含量的三个因素:维生素C加入量、食用醋酸加入量、腌制时间进行单因素分析,采用Design-Expert.V8.0.6.1设计响应面实验,因素水平见表1。

表1 腌制大白菜中亚硝酸盐响应面实验因素与水平编码Table 1 Experimental factors and horizontal coding of nitrite response surface in pickled cabbage

1.3 数据处理

所有的实验数据平行三次,结果表示为平均值±SD。数据用单因素方差分析进行分析,然后用SPSS 21(IBM software,NY,USA)进行Duncan’s检验。显着水平设置为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 亚硝酸盐标准曲线

以吸光度为纵坐标,亚硝酸盐(亚硝酸钠)标准品浓度为横坐标,作标准曲线如图1,求得标准曲线的回归方程为Y=0.8126X-0.074,R2=0.999,在(0～5.0) mg/mL范围内线性关系良好。

图1 亚硝酸盐标准曲线Fig.1 The standard curve of nitrite

2.2 腌制过程亚硝酸盐含量的变化

由图2可以看出:在腌制第8 d亚硝酸盐的含量达到顶峰,高于60.0 mg/kg,严重超出了国标规定(GB 2714-2015食品安全国家标准 酱腌菜)低于20.0 mg/kg的范围。在第8 d之后,随着时间的增加亚硝酸盐的含量逐渐下降,在20 d时,亚硝酸盐的含量为19.8 mg/kg低于国标20.0 mg/kg,并且之后含量也是逐渐降低的,在25 d下降到17.9 mg/kg,食用相对安全。随着腌制天数的增加亚硝酸盐含量先增加后降低,这与岳向冰[13]探究结果一致,只有保证足够的腌制天数,才能确保亚硝酸盐含量不超过国标。因此,接下来的单因素实验均在腌制时间25 d后进行亚硝酸盐的含量测定。

图2 腌制天数对亚硝酸盐的影响Fig.2 The effect of curing days on nitrite

2.3 单因素试验对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响

2.3.1 维生素C浓度对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响 维生素C的加入量对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响比较大。如图3所示,由图3可知,在腌制25 d时,亚硝酸盐含量随着维生素C添加量的增加而降低随后趋于平稳,维生素C添加量在0.01%～0.20%下降,0.02%～0.25%趋于平缓,在0.20%后趋于稳定并出现最低值,其含量为15.1 mg/kg。因此,腌制过程中维生素C的最佳加入量为0.20%。本实验结果与徐海斌[14]研究的腌制大头菜亚硝酸盐含量及降低措施研究的结果一致,维生素C、食用醋酸、温度都会对腌制菜中亚硝酸盐含量有影响。维生素C作为氧化剂,在腌制过程中可以有效的防止微生物对硝酸盐的还原,使得亚硝酸盐含量降低。食用醋酸的加入不仅可以调节腌制菜的风味口感,而且起到降低亚硝酸盐含量的目的。因此,腌制过程中维生素C的最佳加入量为0.20%。

图3 维生素C对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响Fig.3 The effect of vitamin C on the content of nitrite in pickled cabbage

2.3.2 食用醋酸含量对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响 食用醋酸的加入量对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响如图4所示,由图4可知,亚硝酸盐含量随着食用醋酸添加量的增加总体呈现下降趋势,当食用醋酸添加量在10%～12%时,亚硝酸盐含量有一个小的上升波动过程,食用醋酸含量12%时,亚硝酸盐含量16.5 mg/kg。食用醋酸含量增加到14%时,亚硝酸盐含量降低到16.2 mg/kg,与食用醋酸添加量为10%时的亚硝酸盐含量(16.3 mg/kg)相差很小。pH的降低会使微生物生长受限并且亚硝酸盐在食用醋酸存在下可以分解[15],食用醋酸含量在10%之后亚硝酸盐含量有升高趋势,可能是因为过量的食用醋酸也抑制了乳酸菌,使得亚硝酸盐含量升高。考虑生产成本以及过量酸加入会影响口感,所以最适食用醋酸含量范围8%～10%。

图4 食用醋酸对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响Fig.4 The effect of acetic acid on the content of nitrite in pickled cabbage

2.3.3 腌制温度对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响 温度对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响如图5所示,由图5可知,亚硝酸盐含量在20～25 ℃随着腌制温度的增加降低,在25～35 ℃随着温度的增加而增加,35 ℃后降低,在35 ℃时最高为18.4 mg/kg。亚硝酸盐含量随着温度的变化趋势是由微生物决定的,温度低于20 ℃时,微生物生长受到抑制,乳酸菌很大程度发酵收到抑制[16],同样硝酸还原菌的活力也受到抑制。硝酸还原菌活力受到抑制,但是还原反应仍然在缓慢进行,所以低温发酵只是延缓了亚硝酸盐高峰值的到来,延长了腌制周期[17]。25～35 ℃随着温度的增加,亚硝酸盐含量增加,亚硝酸盐含量的高峰值到来比较早,可能因为在适宜的温度范围下有害微生物充分产生亚硝酸盐,故在25～35 ℃下亚硝酸盐含量升高,并且在35 ℃达到最大值。而35 ℃以后,过高的温度抑制微生物生长,所以亚硝酸含量有所降低。为了缩短生产周期和减少成本并保证亚硝酸盐含量较低,综合考虑,最适腌制温度范围为20～30 ℃。

图5 温度对腌制大白菜中亚硝酸盐含量影响Fig.5 The effect of temperature on the content of nitrite in pickled cabbage

2.4 响应面结果及数据分析

2.4.1 响应面实验设计方案及结果 根据单因素实验结果,采用Design-Expert.V8.0.6.1对腌制菜中亚硝酸盐含量进行分析[15,18-20],结果见表2。

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Response surface design scheme and results

2.4.2 方差分析及回归方程拟合 采用Design-Expert.V8.0.6.1对数据进行分析,如表3所示。采用方差分析各因素对腌制大白菜中亚硝酸盐含量的影响情况,该模型的F值为660.99,表明二次回归方差具有显著意义。p<0.0001,表明相关系数具有显著水平,并且该模型适用于对腌制菜中亚硝酸盐含量结果进行分析。由表3可知,各影响因素对腌制大白菜中亚硝酸盐含量的主次顺序为:食用醋酸含量>温度>维生素C含量。

表3 亚硝酸盐含量回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of nitrite content regression model

2.4.3 各因素交互影响 Design Expert.V8.0.6.1软件处理而得的三维响应面图用以阐述三个因素的交互作用和关系。三维响应面图反映变量间的交互作用,图6A为维生素C含量和食用醋酸含量对腌制菜中亚硝酸盐含量的交互作用,当维生素C含量从0.15%增至0.23%、食用醋酸含量从8%升至11.37%,亚硝酸盐含量显著降低,维生素C超过0.23%和食用醋酸超过11.37%后,亚硝酸盐含量趋于升高,并且维生素C和食用醋酸含量作用效果显著(p<0.05)。但是维生素C和温度以及温度和食用醋酸的协同作用不显著,如图6B、图6C。

图6 两两因素交互作用对腌制大白菜中亚硝酸盐含量的影响Fig.6 The effects of two factors on the nitrate content in pickled cabbage

2.4.3 验证实验 根据响应面实验结果,通过Design Expert.V 8.0.6.1求解方程,得出最优条件:食用醋酸加入量11.37%,腌制温度21.24 ℃,维生素C加入量0.23%,腌制25 d,考虑到实际运用和腌制条件的可操作性采用最优腌制条件：食用醋酸加入量11%，腌制温度21 ℃,维生素C加入量0.2%，腌制时间21 d,平行三组实验测得腌制大白菜中亚硝酸盐含量平均值为16.47 mg/kg,显著优于空白组17.9 mg/kg(p<0.05)与理论预测值(16.38 mg/kg)相差0.5%,表明采用响应面法优化腌制大白菜中亚硝酸盐含量具有良好的真实可靠性。

3 结论

本文探究了大白菜腌制过程中的亚硝酸盐含量变化,并得知腌制大白菜一定要保证腌制的天数足够,才能避免因误食腌制天数不足而造成的亚硝酸盐中毒。腌制大白菜在20 d时,亚硝酸盐的含量为19.8 mg/kg低于国标20 mg/kg,且之后也是逐渐降低,在25 d的时候降到17.9 mg/kg,并趋于相对稳定,食用相对安全。食用醋酸加入量、腌制温度、维生素C对腌制大白菜中亚硝酸盐产生量都有显著影响,并且各影响因素对腌制菜中亚硝酸盐含量的主次顺序为:食用醋酸含量>温度>维生素C含量。腌制25 d时,利用响应面优化法最终得到最佳腌制条件为:食用醋酸加入量11%,腌制温度21 ℃,维生素C加入量0.2%,并检测得到腌制大白菜中亚硝酸盐含量16.47 mg/kg,显著低于空白组17.9 mg/kg数值(p<0.05)。因此本文优化腌制条件对生产生活具有良好的指导意义,并为更深入探究其他腌制菜中的亚硝酸盐含量提供依据。