葛仙米多糖理化性质和流变学特性的研究

苏攀峰,唐庆九,陈 盛,王玉兰,赵立彬,许剑锋,刘艳芳,*

(1.上海市农业科学院食用菌研究所,上海 201106;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306;3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;4.湖南炎帝生物工程有限公司,湖南株洲 412000)

葛仙米是多细胞群体的淡水藻类,与地木耳(N.commune)、发菜(N.flagelliforme)同属蓝藻门(Cyanophyta)、蓝藻纲(Cyanophyceae)、段殖藻目(Hormogonales)、念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻属(Nostoc),自古以来就被人们所食用[1-3]。据《本草纲目》记载,葛仙米具有治疗夜盲症和烫伤等功效[2]。现代研究也表明,葛仙米可提高机体的免疫力、抗肿瘤、抗凝血、抗菌和抗氧化能力[4-8]。但环境污染造成野生葛仙米的产量锐减,使其不能满足市场需求。近年来,随着科技的进步,人工培养葛仙米的技术趋于完善[4],这为葛仙米在食品和工业领域的应用提供了保障。对野生与人工培养的葛仙米营养成分分析发现，其营养丰富，总蛋白含量高,富含多种氨基酸、VC、VE和B族维生素等[9]，还富含多糖,含量9%～30%[5,8,11-12]。

目前,对葛仙米多糖的研究主要集中在提取分离和功能评价方面,黄泽波等[13]对热水提取的野生葛仙米和人工培养葛仙米多糖进行了比较,发现野生葛仙米多糖主要含有葡萄糖、半乳糖、木糖和甘露糖,而人工培养葛仙米多糖的单糖组成主要为鼠李糖、墨角藻糖、木糖、甘露糖和半乳糖及葡萄糖。莫开菊等[8,12,14]对野生葛仙米多糖进行了分离纯化,获得糖含量为79.46%、重均分子量Mw为9.564×106Da的多糖组分,主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及半乳糖醛酸甲酯组成,研究还发现该多糖具有低浓度高黏度的良好流变学特性,能够作为食品添加剂进行开发。目前国内外对人工培养葛仙米多糖的研究相对较少,有关人工培养的葛仙米多糖的流变学特性还未见报道。

因此,本文针对人工培养的葛仙米进行提取、得到多糖组分,并对其理化性质和溶液的流变学特性进行了研究,为未来葛仙米多糖的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛仙米 干品，湖南炎帝生物工程有限公司;单糖标品 Sigma公司;三氟乙酸(TFA) Merck公司。

eppendorf AG 22331型高速离心机 Eppendorf公司;eppendorf移液枪 Eppendorf公司;FA2004N型分析天平、DC-2006型低温恒温槽 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;HWS12型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;DA5002C型静音空压机 上海动态实业有限公司;MCR302型旋转流变仪 奥地利安东帕(中国)有限公司;冷冻干燥机 Thermo Savant公司;Waters2695型高效液相色谱仪 美国Waters公司;ICS-2500型高效离子色谱仪 Dionex公司；TSK-GEL系列色谱柱(7.8 mm×300 mm,G6000PWXL. G4000PWXL) TOSOH公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葛仙米多糖的提取分离及含量测定 将葛仙米干品超微粉碎后，取其葛仙米10.0 g,加入蒸馏水、料液比(2 g/L),在100 ℃条件下加热2 h,离心(9000 r/min,15 min)后加入无水乙醇,使乙醇含量(v/v)达到40%醇沉过夜、醇洗4次后加水溶解。真空冷冻干燥得到蓬松状的葛仙米多糖(NSKP)。

参照文献[15-16]报道,采用苯酚-硫酸法测得其多糖含量。

1.2.2 葛仙米多糖的分子量测定 采用高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散色仪-示差折光检测仪联用分析法(HPSEC-MALLS-RI)系统对葛仙米多糖的分子量进行测定分析,方法参考文献[17]。

色谱条件:Waters 2695 HPLC 系统配备UV检测器、示差折光检测器(RI)、多角度激光光散射检测器(MALLS),TSK-GEL系列G6000PWXL和G4000PWXL色谱柱(7.8 mm×300 mm)为分析柱,流动相为0.15 mol/L NaNO3、0.05 mol/L NaH2PO4(pH=7、0.02%的N3Na),柱温30 ℃,流速0.5 mL/min,使用Astra(version 6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析,折光指数增量dn/dc=0.146 mL/g。

上样条件:称取葛仙米多糖2.0 mg,用流动相溶解,离心(10000 r/min,20 min)后过0.22 μm滤膜,上样分析。

1.2.3 单糖组成测定 采用高效离子阴色谱对葛仙米多糖的单糖组成测定,方法参考文献[18-19]。

色谱条件:Dionex公司的ICS2500离子色谱仪,CarboPac PA20阴离子交换分析柱,脉冲安培检测器,流动相为0.480 mol/L NaOH,流速为0.45 mL/min,上样量25 μL,温度为30 ℃。

1.2.4 质量浓度对NSKP溶液表观黏度的影响 用蒸馏水分别配制质量浓度为10、15、20、30、40 mg/mL的NSKP溶液,用流变仪测定不同质量浓度溶液的表观黏度。实验条件:温度20 ℃,以剪切速率为自变量、其变化范围为0.1～1000 s-1,取适量样品于平行板上,采用型号为PP50的平行平板(板间距离1 mm)。

1.2.5 温度对NSKP溶液表观黏度的影响 用蒸馏水分别配制质量浓度为10、15、20 mg/mL的NSKP溶液,用流变仪测定温度对NSKP溶液表观黏度的影响。实验条件:温度扫描范围为20～80 ℃,剪切速率30 s-1,取适量样品于平行板上,采用型号为PP50的平行平板(板间距离1 mm)。

1.2.6 pH对NSKP溶液表观黏度的影响 调节质量浓度为15 mg/mL的NSKP溶液的pH分别为3.0、7.0、11.0(采用HCl和NaOH溶液),用流变仪测定其不同pH条件下的表观黏度。实验条件同1.2.4。

1.2.7 抗氧化剂和氧化剂对NSKP溶液表观黏度的影响 向质量浓度为15 mg/mL的NSKP溶液中分别加入VC、H2O2,使其浓度达到0.02、0.1 mol/L,用流变仪测定多糖溶液的表观粘度。实验条件同1.2.4。

1.2.8 NSKP溶液的动态振荡剪切实验 用蒸馏水分别配制质量浓度为10、15、20 mg/mL的NSKP溶液,用流变仪测定多糖溶液在应变力strain=2%、振荡频率范围为0.1～10 Hz内的储能模量(G′)和损耗模量(G″)。

1.2.9 NSKP与透明质酸的协效性 将NSKP与透明质酸以1∶1的质量比混匀配成5 mg/mL浓度的溶液,以5 mg/mL的NSKP与透明质酸的单溶液为对照。用流变仪测定不同溶液的表观黏度。实验条件同1.2.4。

1.3 数据分析

采用Origin7.0和Excel软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 NSKP多糖含量及分子量分析

经苯酚硫酸法检测,NSKP组分多糖含量为96.95%。采用HPSEC-MALLS-RI系统测定NSKP的分子量,结果显示,该多糖呈现单一对称峰,重均分子量(Mw)为1.324×105Da,与已报道的从野生葛仙米中获得的多糖相比[8],人工培养的葛仙米经水提醇沉得到的多糖组分分子量更小。

2.2 单糖组成

应用高效离子阴色谱分析葛仙米多糖的单糖组成,如图1,结果说明葛仙米多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及葡萄糖醛酸组成,其摩尔比为1∶6.73∶10.84∶5.27∶4.88∶3.92,与野生葛仙米多糖组分相比[8],其单糖组成和摩尔比均有不同,这可能与原料和提取方法不同有关。

图1 样品(a)和标准品(b)的离子色谱图Fig.1 Chromatograms of Nostoc sphaeroids Kutz polysaccharide(a)and standard(b)

2.3 质量浓度对NSKP溶液表观黏度的影响

由图2可知,在剪切速率变化范围为0.1～1000 s-1,NSKP溶液表观黏度会随着其质量浓度的增加而增大,与莫开菊报道的野生葛仙米多糖结果相似[8,14];NSKP溶液的表观黏度会随着剪切速率的增大而降低,说明NSKP溶液具有剪切变稀的特性、是典型的假塑性非牛顿流体;这可能与多糖分子的化学结构和分子构象有关[20]。Singthong等[21]认为多糖分子之间能够通过链-链缠结形成有序结构,而剪切力可以破坏这种有序结构,导致黏度下降。

图2 质量浓度对NSKP溶液表观黏度的影响Fig.2 Effects of Nostoc sphaeroids Kütz polysaccharide concentration on the viscosity of NSKP solution

2.4 温度对NSKP溶液表观黏度的影响

一般情况下,温度是影响多糖分子结构和黏度的重要因素[22]。由图3可以得到,在20～80 ℃范围内,不同质量浓度的NSKP溶液表观黏度随温度升高而降低;在50～80 ℃内,对多糖浓度20 mg/mL的黏度有急剧下降趋势。原因可能是在加热多糖溶液的过程中,分子运动和扩散的剧烈程度增强,导致分子间作用力减小,降低了溶液黏度。

图3 温度对NSKP溶液表观黏度的影响Fig.3 Effects of temperature on the viscosity of NSKP solution

不同多糖溶液黏度对温度的敏感度具有差异性:Xu等[23]对不同质量浓度的乌饭树叶CHSS多糖溶液研究发现,在一定温度范围内,随着多糖浓度的增加,溶液的表观黏度下降程度越大;郭守军等[24]研究发现龙须菜多糖溶液黏度在30～80 ℃内随着温度升高而增加,作者认为由于龙须菜多糖在室温下溶解较慢,随着温度的升高,多糖的溶解性能增加,从而使多糖黏度逐渐增大。

2.5 pH对NSKP溶液表观黏度的影响

从图4得出,不同pH使NSKP溶液的表观黏度发生改变。对于15 mg/mL多糖溶液:在剪切速率相同的条件下,溶液为中性时多糖黏度最大;但在酸性和碱性的条件下,黏度均有不同程度的下降;原因可能是pH变化引起多糖分子间作用力的改变,即分子间的排斥力增大而不利于分子聚集。

图4 pH对NSKP溶液表观黏度的影响Fig.4 Effect of pH on the viscosity of NSKP solution

莫开菊等[8,14]研究野生葛仙米多糖溶液发现:8 mg/mL的多糖浓度溶液黏度随pH的增加而增加。与本研究结果不同,造成本文作者与前人实验结果差异性的原因可能是多糖含量与单糖组成不同。这可能与多糖含量及结构上的差异有关。

2.6 抗氧化剂和氧化剂对NSKP溶液表观黏度的影响

由图5可知,NSKP溶液黏度随着H2O2的增多呈下降趋势;因为H2O2具有较强的氧化性,能够将多糖的羟基氧化,致使多糖分子链断裂,降低多糖溶液黏度[25];加入VC后,NSKP溶液黏度下降,原因可能是VC能够降低多糖分子间的相互作用[25]。

图5 抗氧化剂和氧化剂对NSKP溶液表观黏度的影响Fig.5 Effect of Antioxidant and oxidant on the viscosity of NSKP solution

2.7 NSKP溶液的动态振荡剪切结果

麦克斯韦模型是一个含有存能模量G′和损耗模量G″的二参数模型,被广泛用于描述聚合物溶液的粘弹性[26]。储能模量G′(弹性模量)反映了多糖溶液抵抗形变的能力,损耗模量G″(黏性模量)描述了多糖溶液的黏性特征[27]。二者相交处的频率称为交叉频率。若G′>G″,多糖溶液主要表现为固体弹性性质;若G′

图6结果显示,随着剪切振荡频率的增大,不同质量浓度多糖溶液的G′和G″逐渐升高;且随着NSKP溶液质量浓度的降低,交叉频率逐渐增加。表明增加多糖的质量浓度,能够增大NSKP溶液的成胶趋势和弹性特性,主要是由于浓度增加有利于多糖形成缠绕的网络结构[29]。

图6 振荡频率对不同质量浓度NSKP溶液的存能模量(G′)和损耗模量(G″)的影响Fig.6 The change of solution storage modulus(G′) and loss modulus(G″)of NSKP solution of different concentrations with frequency注:A、B、C分别是NSKP溶液的质量浓度为10、15、20 mg/mL。

2.8 NSKP与透明质酸的协效性

协同增效作用是非常复杂的高聚物大分子之间的相互作用,与高聚物的化学组成、分子结构密切相关[30]。透明质酸具有优良的流变学特性[31],相关材料已被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域[32]。由图7所示,NSKP与透明质酸混合溶液的黏度大于二者单一溶液的黏度,说明NSKP与透明质酸有协效增稠的作用,可能与二者均是酸性黏多糖有关[8,33]。

图7 NSKP与透明质酸的协同增效作用Fig.7 Synergistic interaction of NSKP with hyaluronic acid

3 结论

本研究对人工培养的葛仙米进行提取分离,得到多糖含量为96.95%的高纯度多糖,其分子量为1.324×105Da,单糖组成复杂，主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及葡萄糖醛酸组成。应用旋转流变仪考察了质量浓度、温度、pH、VC和H2O2等因素对多糖溶液表观黏度的影响、探究了其动态黏弹性。结果发现在10～40 mg/mL内,NSKP溶液黏度随质量浓度的增加而升高;NSKP溶液是典型的假塑性非牛顿流体,具有剪切稀释的特性,且黏度随着剪切速率的增大而降低;当pH=7时，黏度达到最大；在20～80 ℃内,溶液黏度随着温度的升高而降低;0.02、0.1 mol/L的VC和H2O2均降低多糖溶液的黏度;可见,NSKP溶液的表观黏度与质量浓度、温度、pH、VC和H2O2等因素有关。

在扫描频率0.1～10 Hz内,储能模量(G′)和损耗模量(G″)随NSKP溶液质量浓度的增加而增大;NSKP溶液的储能模量和损耗模量随频率升高而增加。此外,NSKP与透明质酸有协效增稠的作用,可以考虑将其应用在化妆品方面。