微波辅助提取蛇莓多酚及其体外抗氧化、抑制α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶能力研究

张雪春，刘 江，吴 鑫，沈文杰，李 军，师红玲，王振兴1,*

(1.西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学轻工与食品工程学院，云南 昆明 650224；3.江西师范大学功能有机小分子教育部重点实验室，江西 南昌 330022)

【研究意义】蛇莓(Duchesneaindica(Andr.)Focke in Engler)为蔷薇科蛇莓属植物，别名蛇泡草、龙吐珠、三爪风等，为民间常用草药，广泛分布于中国东部、中部、南部和西南部，传统医学认为其具有清热解毒、消肿散瘀，收敛止血、凉血等功效[1]。蛇莓中含有酚酸类、三萜类、黄酮类、鞣花酸类、甾醇类等化学成分，药理学实验发现蛇莓具有抗肿瘤、抗氧化、抗白血病、抗诱变、抑制中枢神经、抗菌、调节机体免疫功能等功效[2-3]。研究表明，糖尿病及其并发症、阿尔兹海默综合症可能和体内自由基氧化反应均有一定相关性[4-5]，目前治疗2型糖尿病的有效方法是通过抑制体内的α-葡萄糖苷酶活性来降低餐后或者空腹血糖，控制或治疗阿尔兹海默综合症的有效方法是抑制体内乙酰胆碱酯酶的活性。因此研究蛇莓的抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶能力和抑制乙酰胆碱酯酶能力，可为防衰老、糖尿病防治和抗老年痴呆方面的研究提供一定参考，对提高蛇莓的利用价值也有重要意义。【前人研究进展】目前对蛇莓的抗氧化活性、降血糖和防治老年痴呆方面的研究较少，如王予祺[6]发现蛇莓的酚性提取物清除DPPH自由基的IC50值为76.76 μg/mL，能保护小鼠肝脏、脑和恶性肿瘤引起的氧化损伤；赵萍[7]从蛇莓提取液中分离得到13个组分，对DPPH自由基和络氨酸酶的抑制率均可达90 %以上。苟体忠等[8]发现蛇莓的乙醇提取物具有清除DPPH自由基的能力，其IC50值为18.2 μg/mL；刘素君等[9]发现蛇莓的提取物具抑制志贺杆菌、金黄色葡萄球菌的作用，并具有较好的DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基清除能力。【本研究切入点】蛇莓中的酚类成分可能是其主要活性成分[10]，因此，文章以蛇莓多酚为研究对象，研究其最佳提取条件、通过体外试验评价其抗氧化活性、降血糖和防治老年痴呆能力。【拟解决的关键问题】探讨不同微波条件对蛇莓总酚得率的影响，考察其DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、铁还原能力，评价其抑制α-葡萄糖苷酶能力和乙酰胆碱酯酶能力，从而为蛇莓的深入研究提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

蛇莓：采自云南省宣威市海岱镇沙乌村，取其全草经晒干后备用；酿酒酵母a-葡萄糖苷酶、电鳗乙酰胆碱酯酶(AChE)、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)、阿卡波糖(Acarbose)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)、碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)、加兰他敏(Galanthamine，GLTM)，购于Sigma-Aldrich公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2’-联氮,-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、抗坏血酸(Vc)、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、槲皮素(Quercetin，Qc)，以及没食子酸、Folin-Ciocalteus试剂等均为分析纯试剂。

1.2 主要仪器

BT244S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)、P70D20P-TD(W0)型微波炉(广东格兰仕微波炉电器制造有限公司)、DGH-9140A数显电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、RE-52系列旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、SYNERGY H1多功能酶标仪(美国BIOTEK公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 微波辅助提取蛇莓多酚 蛇莓全草经粉碎后过40目筛，取1.0 g蛇莓粉，加入一定体积的甲醇溶液，搅拌均匀，以保鲜膜覆盖，置于微波炉中微波辅助提取一定时间，提取后进行抽滤，取滤渣以相同条件再次提取1次，合并前后2次滤液，在50 ℃下真空旋干，即得到蛇莓多酚(DI)。

1.3.2 单因素试验设计 分别固定其它因素，依次考察甲醇浓度(50 %、60 %、70 %、80 %、90 %)、料液比(1︰10、1︰15、1︰20、1︰25、1︰30，W/V)、微波时间(30、60、90、120、150 s)、微波功率(119、280、462、595、700 W)对总酚得率的影响。

1.3.3 条件优化 在单因素试验的基础上，以料液比、微波时间、微波功率、甲醇浓度为自变量，以总酚得率为响应值，利用Box-Behnken原理，设计4因素3水平中心组合试验，用Design-Expert8.05b软件进行响应面优化分析，确定最佳提取条件，因素水平编码表见表1。

1.3.4 总酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu法[11]测定总酚含量，用酶标仪在765 nm处测定，以不同浓度的没食子酸为标准物绘制标准曲线，以没食子酸当量(g GAE/mL)表示蛇莓提取物中总酚含量，按下式计算样品中总酚得率。

(1)

式中：V为提取液体积(mL)；C为提取液中多酚浓度 (g GAE/mL)；N为稀释倍数；m为样品质量(g)。

1.3.5 蛇莓提取物清除DPPH自由基能力的测定 参考王白娟[12]的方法，采用酶标仪在517 nm处测定，以Vc、BHT和槲皮素(Qc)为阳性对照。

1.3.6 蛇莓提取物清除ABTS+自由基能力的测定 参照Xie[11]的方法，采用酶标仪在734 nm处测定，以Vc、BHT和槲皮素为阳性对照。

1.3.7 蛇莓提取物铁还原能力的测定 参考马承慧[13]的方法，采用酶标仪在593 nm处测定，以FeSO4为标准物绘制标准曲线，样品的铁还原能力(FRAP)用FeSO4当量表示(μg FeSO4/g)，同时以Vc、BHT和槲皮素为阳性对照。

1.3.8 蛇莓提取物抑制α-葡萄糖苷酶能力的测定 参考Liao[14]的方法并加以改进，取50 μl稀释到合适浓度的样品溶液加入96孔黑色荧光酶标板中，加入50 μl 4-MUG溶液(84 μM，用50 mM pH 6.8磷酸钾缓冲液配置)，再加入20 μl α-葡萄糖苷酶溶液(0.1 U/mL，用50 mM pH 6.8磷酸钾缓冲液配置)，充分混匀后在37 ℃避光温育20 min，再加入100 μl甘氨酸-NaOH溶液(100 mM，pH 10.6)终止反应，振荡30 s，最后在激发波长355 nm，发射波长460 nm下测定荧光强度(As)，以样品溶剂代替样品的反应为空白(Ac)，用磷酸钾缓冲液代替α-葡萄糖苷酶溶液的反应为样品空白(Ab)，抑制率计算按下式(2)，同时以阿卡波糖为阳性对照。

(2)

1.3.9 蛇莓提取物抑制乙酰胆碱酯酶能力的测定 参考Sheeja[15]的方法，采用酶标仪在405 nm处测定，以加兰他敏为阳性对照。

1.3.10 数据分析 所有试验均测定3次，以平均值±标准偏差来表示试验结果。采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，采用Design Expert 8.05b软件进行响应面试验设计和数据分析，采用Origin 2017软件进行曲线拟合来计算IC50值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素试验结果如图1中a、b、c、d所示。由图1a可知，蛇莓总酚得率随甲醇浓度的增大而呈现先上升后下降趋势，当甲醇浓度为70 %时总酚得率达到最高值5.2 %±0.29 %，此时继续增大甲醇浓度，得率反而下降。由图1b可知，蛇莓总酚得率随料液比的增大而呈现先上升后缓慢下降趋势，当料液比为1∶20时，总酚得率最高，达5.14 %±0.2 %。图1a和图1b的结果和郭婕[16]等人的报道是一致的，主要是因为植物中的不溶性酚类在细胞壁上与蛋白质、多糖以氢键和疏水键结合，甲醇-水溶液可以破坏氢键，使得酚类物质溶出。提取溶剂中水的比例过高，多糖等成分溶出较多。提取溶剂中甲醇过高，可引起细胞中蛋白质变性，影响酚类物质溶出。增大溶剂用量，有利于多酚由原料向溶剂扩散，增加其提取率，但溶剂用量过大，需要浓缩蒸发等处理的时间更长，酚类物质更容易降解，导致得率下降，且造成溶剂浪费。

由图1c可知，蛇莓总酚得率随微波时间的延长而呈现先上升后下降趋势，当微波时间为120 s时达到最高的5.09 %±0.16 %。由图1可知，当微波功率为280 W时，总酚得率达到最高的5.06 %±0.19 %，之后随着微波功率的增大，总酚得率呈下降的趋势。原因是延长微波时间或者增大微波功率，提取液的温度不断上升，使酚类物质的溶出量增大；但当微波时间过长或者功率过大，使得提取液的温度过高，导致部分酚类物质被氧化或分解，从而使得率下降。

图1 提取条件对总酚得率的影响Fig.1 Effect of each condition on the content of total phenols

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素试验结果，依次选择甲醇浓度、料液比、微波功率、微波时间为响应面因素，以蛇莓总酚得率为响应值，通过Design Expert 8.05b软件，设计4因素3水平响应面试验进行提取优化，因素水平表和试验结果见表1～2。

表1 响应面因素及水平表

表2 Box-Behnken试验设计和总酚得率结果

表3 回归模型方差分析和系数显著性检验

对表2中试验结果进行回归分析，得到回归模型方程Y=5.09-0.15A-0.070B-0.16C-0.098D-0.050AB-0.16AC-0.050AD-0.028BC-0.57BD-0.21CD-0.14A2-0.34B2-0.55C2-0.48D2。模型系数显著性结果和方差分析结果见表3。

对方程进行优化，剔除不显著项AB、AD、BC，得到优化后的方程Y=5.09-0.15A-0.070B-0.16C-0.098D-0.16AC-0.57BD-0.21CD-0.14A2-0.34B2-0.55C2-0.48D2。由表3可知，此模型的P值极显著(P<0.0001)，R2=0.9792，表示方程能较好地反映各因子与响应值的关系并预测最佳合成条件，失拟项P值为不显著，表明模型拟合程度较好，可用此模型对微波提取蛇莓总酚进行分析和预测。

2.2.2 各因素相互作用分析 根据优化后的回归方程，分别作各因素之间的响应面分析图，各因素交互作用对蛇莓总酚得率的影响结果见图2，各因素相应曲线的陡峭程度反映了该因素对蛇莓多酚得率的影响程度，各因素交互作用的等高线呈椭圆形，则说明两者交互作用极为显著。由图2结合表2方差分析可知，各因素对蛇莓总酚得率的影响次序：微波功率>料液比>甲醇浓度>微波时间。

2.2.3 最优条件的验证 对方程求导可知，当料液比为1∶18.35、微波时间为109.33 s、微波功率为264.66 W、甲醇浓度为66.66 %时，总酚得率最高，其理论值为5.15 %。在该条件进行验证实验。为方便操作，选取料液比为1∶18、微波时间为110 s、微波功率为280 W、甲醇浓度为67 %，试验平行3次，测定总酚得率为5.21 %±0.16 %，接近理论值，证明该模型可行。

2.3 蛇莓多酚体外抗氧化能力试验结果

2.3.1 清除DPPH自由基能力 DPPH是一种以氮为中心的稳定自由基，样品对DPPH自由基清除能力代表样品具有清除羟自由基、烷自由基、过氧自由基、阻止脂质过氧化反应的作用，常用于反映样品抗氧化能力强弱[6]。由图3可知，蛇莓多酚具有较强的清除DPPH自由基能力，且清除能力随着样品浓度的增大而增强。蛇莓多酚清除DPPH自由基的IC50值为(8.63±0.4)μg/mL，接近于Vc(8.13±0.52)μg/mL，显著低于BHT(17.7±0.52)μg/mL和槲皮素(81.1±6.04)μg/mL。

图2 各因素和总酚得率的交互作用Fig.2 Response surface and contour plots for the effect of operating parameters on the total phenol yield

图3 蛇莓多酚与对照清除DPPH自由基的能力Fig.3 The DPPH scavenging ability of sample and control

图4 蛇莓多酚与对照清除ABTS+自由基的能力Fig.4 The ABTS+ scavenging ability of sample and control

2.3.2 清除ATBS+自由基能力 ABTS法是使用最广泛的抗氧化能力间接检测方法，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。ABTS+溶液可释放稳定的有机自由基，样品中的还原性物质可提供电子，与该有机自由基反应，因此可通过测定反应体系吸光度的变化，来反映样品抗氧化能力的大小。由图4可知，随着蛇莓多酚浓度的增大，其对ABTS+自由基的清除能力不断增强，在浓度为75.68 μg/mL时清除率达到98.46 %±0.4 %。蛇莓多酚清除ABTS+自由基的IC50值为(32.11±1.48)μg/mL，虽然高于Vc(19.15±0.56)μg/mL和BHT(20.81±0.82)μg/mL，但显著低于槲皮素(66.47±2.03)μg/mL。

图5 蛇莓多酚与对照的FRAP能力Fig.5 The FRAP ability of sample and control

2.3.3 铁还原能力 在酸性条件下，Fe3+与TPTZ生成复合物，样品中的还原性物质可将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+在593 nm处有最大吸收，因此可通过测定反应体系在593 nm处的吸光度值，以FeSO4为标准物质来反映样品铁还原能力，结果记为FRAP值，FRAP值越大，表明该样品的总抗氧化能力越强[17]。由图5可知，蛇莓多酚的FRAP值为(2 190.32±6.46)μg FeSO4/mL，低于Vc(5 368.06±237.77)μg FeSO4/mL和BHT(3 002.22±102.88)μg FeSO4/mL，接近槲皮素(2 386.96±168.68)μg FeSO4/mL。可能是因为样品中的其他各种成分如胶体、淀粉、蛋白等物质干扰了反应体系中Fe3+与TPTZ生成复合物，导致反应体系中产生的Fe2+浓度低于对照的Vc和BHT。

2.4 抑制α-葡萄糖苷酶能力试验结果

糖尿病是一种全球性的慢性疾病，它可引起患者代谢异常，不仅导致高血糖症，而且引起许多并发症，严重危害人类健康，控制并降低患者的血糖含量(特别是餐后血糖含量)是糖尿病防治的关键措施。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是目前已经确定的对Ⅱ型糖尿病有着确切疗效的降糖类药物，其通过可逆性竞争抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而延缓小肠对葡萄糖的吸收利用，达到降低餐后血糖水平的目的[18]。如图6所示，蛇莓多酚抑制α-葡萄糖苷酶的能力随浓度增大显著增大，其IC50值为(223.89±51.07 )μg/mL，低于对照物阿卡波糖(310.81±56.73)μg/mL，表明蛇莓可以作为一种高效的天然降血糖资源。

2.5 抑制乙酰胆碱酯酶能力试验结果

阿尔茨海默病，即老年性痴呆症，是最常见的老年化神经衰退症。患者大脑内神经递质乙酰胆碱的缺失是导致疾病的关键原因，乙酰胆碱酯酶(AChE)可催化乙酰胆碱的裂解，导致乙酰胆碱缺失，因此抑制AChE的活性是临床上治疗阿尔兹海默综合症的重要手段[19]。由图7可知，在试验浓度范围内，蛇莓多酚抑制AChE的能力随浓度增大而增大，其IC50值为(202.95±22.68)μg/mL，与Khuda[20]的结果(226±0.26)μg/mL基本一致，虽然低于对照物加兰他敏的(1.06±0.13)μg/mL，但显著高于一些常见药材的3～15 mg/mL[21]。

3 讨 论

文章采用微波辅助提取蛇莓多酚，微波辅助提取是微波和传统的溶剂提取法相结合的一种提取方法，在萃取过程中，微波能量使得物料细胞内部破裂，其有效成分自由流出，在较低温度下溶解于萃取介质中，具有高效、低温、可选择性萃取等优点[22]。以总酚得率为考察指标，相比传统浸泡提取方法[23]，文章的提取时间由3～7 d缩短至112 s，多酚得率由2.14 %提高至5.21 %，提取物的抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶能力都有显著的提高。因此，微波辅助提取适用于蛇莓中活性成分的高效提取。

体外抗氧化试验表明，蛇莓多酚对DPPH自由基、ATBS+自由基有较强的清除能力，接近或者超过常用的商业化抗氧化剂Vc和BHT，显著高于槲皮素。其铁还原能力虽然低于Vc和BHT，但接近槲皮素。蛇莓中的多酚类化合物可能是其主要活性物质，可经进一步分离纯化后，开发为天然抗氧化剂。

图6 蛇莓多酚与对照的抑制α-葡萄糖苷酶能力Fig.6 The a-glucosidase inhibitory activity of sample and control

图7 蛇莓多酚与对照的抑制AChE能力Fig.7 The AChE inhibitory activity of sample and control

文章选择以4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)为底物，通过测定其荧光强度变化的方法来评价样品抑制α-葡萄糖苷酶的能力。相比常规以p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物的方法，4-MUG法的底物稳定时间是pNPG法的2～3倍，且可用于测定溶解性不好、易出现浑浊的样品，其结果灵敏、重现性好。实验结果表明，蛇莓多酚具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶能力，且采用微波辅助提取方法得到的蛇莓多酚的抑制能力高于其他水提和常温浸泡方法[20-23]。

乙酰胆碱酯酶活力抑制实验结果表明，蛇莓多酚具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶能力，但其抑制能力和他人报道的结果较为相近[20]，因此，不同提取方法对其抑制乙酰胆碱酯酶的能力影响不大。

4 结 论

微波辅助提取适用于蛇莓中有效成分的提取，以总酚得率为考察指标，最佳提取条件为甲醇体积分数67 %，料液质量体积比1︰18，微波功率280 w，微波时间为112 s，在此条件下蛇莓多酚的提取率为5.21 %±0.16 %。蛇莓多酚具有较强的体外抗氧化活性，其清除DPPH自由基的IC50值为(8.63±0.4)μg/mL，清除ABTS+自由基的IC50值为(32.11±1.48)μg/mL，铁还原能力为(2190.32±6.46)μg FeSO4/mg。蛇莓多酚抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值为(223.89±51.07)μg/mL，低于标准对照物阿卡波糖。抑制乙酰胆碱酯酶能力的IC50值为202.95 μg/mL，可开发为天然抗氧化剂和降血糖、防治老年痴呆药物。