百合AGPase基因RNAi载体构建及遗传转化研究

张进忠，孙嘉曼，李朝生，刘挺燕，范燕萍

(1. 华南农业大学林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2. 广西农业科学院生物技术研究所，广西 南宁 530007；3. 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007)

【研究意义】食用百合地下鳞茎富含淀粉，是人们青睐的食材。百合鳞茎的形成、发育、生长与其淀粉、糖的合成与分解代谢密切相关[1]，其繁殖过程依赖于鳞片再生种球，更依赖于淀粉的合成代谢，作为繁殖材料，鳞茎种球的膨大发育与淀粉的合成积累成正相关[2-3]；在淀粉合成关键酶中，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)被认为是淀粉合成的限速酶[4]，该酶与尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)酶偶联，形成了蔗糖经萄糖-1-磷酸(G-1-P)形式转化为腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)的合成路线，所生成的ADPG做为淀粉合酶的底物形成糖苷键延长合成淀粉。因此，AGPase对于以淀粉为收获物的作物非常关键，对其基因的作用机理和调节模式进行相关研究，探索出能提高生物淀粉产量、改善淀粉品质的技术有利于农业生产。【前人研究进展】AGPase基因表达与生物淀粉的合成积累已有相关研究，一般认为其在植物体内过表达能显著提高淀粉合成速率与含量，而反义调节则显著下调其合成[5-7]，然而对其具体作用的分子机理虽有报道，但仍知之甚少。在AGPase蛋白酶的多态性研究结果表明不同作物的AGPase酶存在多态性，所执行的功能各异，但都与淀粉合成有关；通过测序发现不同类型马铃薯中存在5种类型的AGPase酶，当酶为ISQV类型时，淀粉合成明显高于其他拷贝类型[8]；岳向文等[9]通过凝胶电泳鉴定出了60个小麦品种5种AGPase基因型，其中AGPabcd基因型酶活与淀粉含量最高，且各基因型具有不同的遗传效应，AGPase大亚基的某些单核苷酸多态性(SNP)与穗粒数和千粒重密切相关[10]；在对AGPase与木薯淀粉积累关系的研究中发现，木薯AGPase具有4种同工酶，其中AGPa、AGPb、AGPc基因型能显著影响木薯块根的淀粉积累[11]；在水稻AGPase酶研究中发现了7种同工酶基因型，其中AGPS2b、AGPL2、AGPL3表达较强，是水稻胚乳中AGPase基因表达的主要形式[12]。涉及AGPase其他功能的研究目前较多。RNAi是研究基因功能、探索基因表达信号传导通路的重要工具，在多种作物上进行基因功能的鉴定及创制新种质研究中发挥着重要作用。其通过RNAi沉默HMA2基因，阐明其介导镉长距离运输在马蔺适应重金属镉污染环境中的作用机制[13]，构建沉默木薯eIF4E7基因的干扰载体，使木薯褐色条斑病毒与乌干达木薯褐色条斑病毒侵染时缺少翻译起始因子，从而达到抗病毒的目的[14]；通过RNAi过抑制大豆内源GmPEPc基因表达，增加油脂积累，获得高油的转基因大豆新品种[15]，这些表明RNAi技术在研究基因功能和创新抗逆性、高品质种质有巨大的潜力。【本研究切入点】食用百合淀粉合成酶类基因与百合繁殖方式——鳞茎形成、膨大发育密切相关，而目前关于此类基因的研究非常少。【拟解决的关键问题】利用Gateway基因沉默技术，通过构建保守区域干扰表达载体并转化植株，探索AGPase转录后水平的表达情况，为该基因功能的进一步研究及今后百合组培鳞茎膨大繁育基因调控技术的开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物材料 兰州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)组培苗，由广西农业科学院生物技术研究所提供。

1.1.2 菌株与质粒载体 农杆菌GV3101(pMP90RK)感受态，大肠杆菌DH5α；入门载体pDONR221，目的载体pJawohl8-RNAi，具有AGPase基因(登录号：KP751443)的pMD18-T克隆质粒由本实验室保存。

1.1.3 主要试剂 GatewayTMBP ClonaseTMII Enzyme mix，规格100T，货号11789100(Invitrogen)；GatewayTMLR ClonaseTMEnzyme mix：规格20T，货号11791019(Invitrogen)；TaqDNA聚合酶、限制性内切酶购自TaKaRa，RNA提取试剂Trizol购于Invitrogen；逆转录试剂RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit：规格20T，货号K1621(Thermo Scientific)；DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50购于Axygen；PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR Premix ExTaqTMII(Perfect Real Time)购于TAKARA；其余常规试剂为进口或国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 目的序列的扩增 根据基因序列，选择中间300 bp保守区域作为干扰片段，利用Primer 5.0设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成，其中通用引物为：

TF:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGG CT-3′

TR:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG GT-3′

含部分attB接头的基因特异性引物为：

F:5′-AAAAAGCAGGCTTGAAGGAATTCggtaccG AGAACCCCAACTGGTTTCAGGG-3′，酶切位点Acc65I；

R:5′-AGAAAGCTGGGTTGCGGCCGCActcgag G GGGTATCAACCTTCATTGCCTTC-3′，酶切位点XhoI。

以带有目的片段的质粒为模板，加含有部分attB接头的基因特异性引物(F、R)，进行第1轮PCR，然后以第1轮PCR产物为模板，加入通用引物，进行第2轮PCR。

PCR反应程序如下：将下列试剂于冰盒中溶解，并按以下次序将各组分在PCR管内混匀：模板1 μl，10×Buffer 5 μl，2 mM dNTP 5 μl，正反向引物各4 μl，25 mM MgCl23 μl，Taq1 μl，ddH2O 26 μl。扩增程序如下：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。1 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收扩增的PCR产物并纯化。

1.2.2 构建入门克隆(将PCR产物构建进入门载体中) ①BP重组反应。反应体系组分如下：attB-PCR产物5 μl(>10 ng)，pDONR221(150 ng/μl)1 μl，5×BP Clonase enzyme mix 2 μl，TE Buffer 4 μl。反应体系放于25 °C下温育10 h，反应终止后，加2 μl的Proteinase K(2 μg/μl)在37 °C下处理10 min。反应产物应为含有目的片段的入门克隆pDONR-AGPase。②转化。取100 μl DH5α感受态细胞，加入至上述反应体系中，冰上30 min，然后42 ℃水浴热击90 s，迅速放于冰上2 min，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养皿上，37 ℃培养15 h。③PCR法筛选重组克隆。将LB平板倒置，常温下随机挑选平板上的阳性克隆并编号。每个PCR管里分装16 μl ddH2O和正反向载体引物1 μl(5 pmol/μl)，用枪头在LB平板上轻点取转化菌，然后将沾有菌体的枪头置于相应的PCR管中吹打数次使其混合；将PCR其他组分配成PCR mix分装于每个PCR管中，总体积达到25 μl，然后混匀，盖紧管子。PCR mix配方如下：10×TaqReaction Buffer(Mg plus)2.5 μl，dNTP(10 mM)0.5 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl，ddH2O 4.8 μl。将混有菌体的PCR混合物短暂离心后置于PCR仪中，PCR反应程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min。凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.3 构建干扰表达载体(将入门克隆中的目的基因转移至目的载体) ①LR重组反应。将下列试剂于冰盒中溶解，并按以下次序将各组分在1.5 mL离心管内混匀(总体积20 μl)：pDONR-AGPase(≥100 ng/μl)3 μl，LR ClonaseTMReaction Buffer 4 μl，5×LR ClonaseTMenzyme mix 4 μl，pJawohl8-RNAi(≥300 ng/μl)1 μl，ddH2O 8 μl。移液枪混匀后并短暂离心，置于25 ℃下孵育过夜。加2 μl的Proteinase K(2 μg/μl)在37 °C下处理10 min。反应物应为含有正反向AGPase片段且中间有内含子的干扰表达载体：pJawohl8-RNAi-AGPase，取5 μl用于转化。②转化。取100 μl DH5α感受态细胞，加入至上述反应体系中，冰上孵育30 min，然后42 ℃水浴热击90 s，迅速回放于冰上2 min，涂布到含有氨苄青霉素的LB固体培养皿上，37 ℃培养15 h。③PCR法筛选重组克隆。将LB平板倒置，常温下随机挑选平板上的阳性克隆并编号。每个PCR管里分装16 μl ddH2O和正反向载体引物1 μl(5 pmol/μl)，用枪头在LB平板上轻点取菌；将沾有菌体的枪头置于相应的PCR管中吹打数下。将PCR其他组分配成PCR mix分装于每个PCR管里，使总体积达到25 μl，然后混匀，盖紧管子。PCR mix配方同上。将混有菌体的PCR混合物短暂离心后置于PCR仪中，PCR反应程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 10 min。电泳检测PCR产物，选择出含目的片段的阳性克隆，再进行Acc65I、NheI与SpeI酶切鉴定。④重组质粒测序。挑选阳性克隆接种到5 mL LB/含氨苄青霉素的液体培养基中，37 °C摇床培养15 h，提取质粒送测序。

1.2.4 干扰载体转化农杆菌 取出农杆菌GV3101感受态细胞于冰上冻融；加2 μl所构建的干扰载体质粒于100 μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀；取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中，在2500 V高压下电击；取出电击杯，加入500 μl预冷的YEB培养液，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5 mL离心管中，28 ℃，200 r/min振荡培养5 h。取30 μl转化的菌液涂在含相应抗生素的YEP培养基平板上(含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平)，28 ℃避光倒置培养2 d后长出菌落，用接种环挑取单菌落接种于YEB液体培养基中(含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平)，震荡过夜培养。用特异引物进行菌液PCR检测阳性克隆，并扩大培养后-80 ℃保存备用。

1.2.5 遗传转化和筛选 取培养好的百合愈伤组织，用锋利手术刀片将愈伤组织切成0.5 cm2的小块(带有伤口)，备用。取培养过夜的含有干扰载体的GV3101菌液，4000 r/min，室温离心10 min，用MS盐溶液重新悬浮菌体，使用时用MS盐溶液稀释至原体积的20倍。将准备好的组培块在菌液中侵染10 min后取出，无菌滤纸吸去植物材料表面菌液，转移到铺有一层无菌滤纸的MS培养基上，28 ℃暗培养，共培养3 d。共培养后将材料转移到分化培养基(MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.05 mg/L)上培养，28 ℃，光周期8L∶16D，直至长出新苗。

1.2.6 转化植株的荧光定量PCR检测 以转化空质粒农杆菌GV3101的百合苗为对照，荧光定量PCR检测经农杆菌GV3101转化的含有AGPase干扰载体的植株AGPase基因相对表达量；取各处理的叶片下部膨大组织，使用TRIzol Reagent试剂盒抽提植物组织mRNA，使用PrimeScript RT Master Mix将mRNA拟转录成cDNA，特异性引物为：

18s F: 5′-TTCATATCACGTGCTGCATGG-3′

18s R: 5′-AGACGACTTCGGTGAGACG-3′

AGPase-F: 5′-GAGAACCCCAACTGGTTTCAG-3′

AGPase-R: 5′-GGTATCAACCTTCATTGCCTT-3′

以18s rRNA作为内参，使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒扩增目的片段和18s rRNA，反应条件设置为：95 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。计算各基因的△CT，并采用2-△△CT法计算mRNA转录倍数，3次重复；采用SPSS 19.0 进行t检验统计分析。

2 结果与分析

2.1 目的干扰序列克隆

经过比对，选定的序列是AGPase(登录号：KP751443)基因保守区域300 bp序列；图1泳道1和2显示的是经过两轮PCR扩增出来的片段条带，该条带约为400 bp(含attB接头)，符合预期大小，表明扩增出了所选的AGPase基因干扰片段。

2.2 AGPase RNAi片段装入到入门载体后菌落PCR结果

将所扩增的含有attB接头的干扰片段与入门载体pDONR221进行BP反应，发生特异性位点重组形成入门克隆pDONR-AGPase与副产物。图2为所设计引物对BP反应后的菌液PCR结果，其泳道1、2具有400 bp的清晰条带，表明入门载体pDONR-AGPase已构建成功。

M：分子量标记；1～2：目的序列M: Marker; 1-2: Target sequence图1 目的基因AGPase干扰片段Fig.1 The interference fragment of target gene AGPase

M：分子量标记；1～2：目的序列M: Marker; 1-2: Target sequence图2 BP反应后菌液PCR结果Fig.2 PCR results of bacterial solution after BP reaction

2.3 入门载体pDONR-AGPase与目标载体pJawohl8-RNAi进行LR反应

入门载体pDONR-AGPase与目标载体pJawohl8-RNAi的LR反应后转化大肠杆菌培养，对菌液进行PCR验证，结果显示扩增出了400 bp的条带(图3泳道1、2)，与预期相符，表明经过LR反应，干扰序列成功转入到目的载体，形成了所需的干扰表达载体pJawohl8-RNAi-AGPase。

2.4 干扰表达载体pJawohl8-RNAi-AGPase酶切结果

为进一步验证表达干扰载体pJawohl8-RNAi-AGPase成功构建，选择重组质粒载体上Acc65I、NheI与SpeI酶切验证。如图4所示，泳道1为pJawohl8-RNAi目的载体9019 bp；泳道2为pJawohl8-RNAi的NheI与SpeI双酶切，显示有约4300与4700 bp 2个条带，NheI在质粒的8084 bp处，SpeI在质粒的3803 bp处，计算结果与条带大小相符合，因其大小太相近，两条带接近在一起；泳道3为pJawohl8-RNAi的Acc65I酶切，因该载体没有Acc65I酶切位点，所以还是呈现与泳道1大小一样的条带；泳道4为构建好的pJawohl8-RNAi-AGPase干扰表达载体，其大小约6540 bp；泳道5为pJawohl8-RNAi-AGPase干扰表达载体NheI与SpeI双酶切结果，考虑到上述NheI与SpeI酶切位点位置，所以应具有约4280 bp与2260 bp条带，泳道5条带与此相符合；泳道6为pJawohl8-RNAi-AGPase干扰表达载体Acc65I酶切结果，应具有1026 bp与5514 bp条带，结果与预测一致；泳道4、5、6的结果表明了pJawohl8-RNAi-AGPase干扰表达载体构建成功。图5为最终成功构建的pJawohl8-RNAi-AGPase质粒图谱。

M：分子量标记；1～2：目的序列M: Marker; 1-2: Target sequence图3 LR反应后菌液PCR结果Fig.3 PCR results of bacteria solution after LR reaction

M：分子量标记；1：目的载体pJawohl8-RNAi；2：目的载体pJawohl8-RNAi的NheI与SpeI双酶切；3：目的载体pJawohl8-RNAi的Acc65I酶切；4：干扰表达载体pJawohl8-RNAi-AGPase；5：干扰表达载体pJawohl8-RNAi-AGPase的NheI与SpeI双酶切；6：表达干扰载体pJawohl8-RNAi-AGPase的Acc65I酶切M: Marker; 1: Destination vector pJawohl8-RNAi; 2: Digestion of pJawohl8-RNAi vector by NheI and SpeI enzyme; 3: Digestion of pJawohl8-RNAi vector by Acc65I enzyme; 4: Expression vector pJawohl8-RNAi-AGPase; 5: Digestion of expression vector of pJawohl8-RNAi-AGPase by NheI and SpeI enzyme; 6: Digestion of pJawohl8-RNAi-AGPase vector by Acc65I enzyme图4 干扰表达载体pJawohl8-RNAi-AGPase酶切结果Fig.4 Digestion of interference vector pJawohl8-RNAi-AGPase

图5 最终构建的pJawohl8-RNAi-AGPase质粒图谱Fig.5 Constructed pJawohl8-RNAi-AGPase plasmid map

M：分子量标记；A：pJawohl8-RNAi-AGPase干扰质粒；AG：转化到农杆菌的干扰质粒M: Marker; A: Interfering plasmid pJawohl8-RNAi-AGPase; AG: Interfering plasmid translated into Agrobacterium图6 干扰片段的检测Fig.6 Detection of interference fragments

2.5 干扰质粒转化农杆菌PCR鉴定

通过电击法将构建好的表达干扰载体转入感受态农杆菌GV3101中，经过Kan、Rif、Amp抗性筛选，只有转化菌株才能生长，进一步对转化菌株进行PCR检测；用AGPase干扰片段的引物(AGPase-F，AGPase-R)PCR扩增干扰质粒和转化到农杆菌干扰质粒，以检测所构建的pJawohl8-RNAi-AGPase干扰质粒是否转化到农杆菌，并获得阳性克隆。图6所示A为pJawohl8-RNAi-AGPase阳性对照，AG为提取转化的农杆菌质粒进行PCR，都具有300 bp大小的条带，与所克隆的干扰片段大小相符合，表明构建的干扰质粒成功转化到农杆菌GV3101中。

2.6 荧光定量PCR检测AGPase基因转录后抑制

提取转化植株RNA反转录为cDNA进行荧光定量PCR检测，以比较转化植株与非转化植株AGPase基因相对表达量(图7)，结果显示转化含干扰质粒菌株的植株AGPase相对表达量大幅度降低，为对照的27.2 %。表明转入的干扰片段对其转录的mRNA发生沉默作用。

3 讨 论

本研究前期研究表明蔗糖能促进百合小鳞茎膨大发育，此处蔗糖作为百合生长利用的碳源具有以下作用：第一，作为合成淀粉的原料；第二，作为信号因子调控AGP相关启动子表达，从而正调控AGP，AGP上调进一步提高了淀粉的合成。此外，植物激素在对AGP调控中也起到了非常重要的作用。AGPase基因的直接转录激活子尚未确定，Nagata等[16]从拟南芥cDNA中分离出转录因子AtWRKY20，通过粒子轰击瞬时表达AtWRKY20，可增强ApL3启动子的表达，启动编码一个蔗糖诱导的AGPase大亚基基因。AtWRKY20还激活编码甘薯AGPase小亚基基因的ibAGP1启动子。在AGPase蛋白结构研究中发现一个横跨Pro103-Arg115的区域与AGPase酶底物结合及变构部分移动强烈相关，动态网络路径分析表明激活剂结合残基(Lys39)及ATP的主要传达通路与Pro103-Arg115残基环有关，分子动力学表明Pro103-Arg115环在AGPase酶的变构反应中起着重要的作用，此为一个只存在于变构调节的糖核苷酸焦磷酸化酶中的独特元件，可能是连接变构和催化位点触发机制的一个关键部分[17]。通过单点突变研究发现大肠杆菌AGPase生理负性和正性变构调节剂分别为腺苷-5-单磷酸腺苷(AMP)和果糖-1,6-二磷酸(FBP)，并由此提出了AGPase蛋白酶催化活性调控模型[18]，并发现了一个与活性位点保持信息通路的传递变构信号的关键区域[19]，这对理解AGPase变构调节具有重要意义。越来越多的研究证据阐述了AGPase的多态性、调控信息通路、分子结构变构调节与功能的关系等，本研究基于AGP响应于植物激素、碳源等因子调控作用下探索其功能研究的反向遗传学方法，为下一步开展相关调控因子在百合鳞茎发育中的调控机制研究提供技术。

O：转化含有空质粒农杆菌的植株；A：转化含有AGPase干扰质粒农杆菌的植株O: Transformation of plant containing Agrobacterium; A: Transformation of plant containing Agrobacterium transformed with interfere plasmid图7 转化植株AGPase基因相对表达量Fig.7 Relative expression of AGPase Gene in transformed plants

Pinto等[20]利用RNAi将水稻黄斑病毒复制酶基因导入水稻培育出具有黄斑病毒抗性的水稻；柴晓杰等[21]采用 RNAi 技术能有效下调玉米支链淀粉含量。Gateway技术利用位点特异性重组原理实现片段定向转移而得到方向正确的重组，其构建RNAi载体相对于传统的酶切连接构建载体有方便、快捷、高效等优势[22]，只需获得带有目的干扰片段的入门克隆，通过LR反应就可将目的片段转入所需要的表达载体中，满足研究不同表达载体在不同生命体中的表达特征及目的基因的功能验证。本研究采用兼容Gateway的植物基因沉默双元载体pJawohl8-RNAi质粒带有280 bp的内含子，将干扰序列分别正反向连接在两边，可有效表达dsRNA，形成siRNA实现基因沉默，所带有的抗除草剂草铵膦抗性基因，有利于转化后对转基因植株的筛选，为研究该基因功能提供了材料与技术。

4 结 论

本研究选择AGPase保守序列作为干扰片段，通过Gateway技术成功构建pJawohl8-RNAi-AGPase表达载体，并对百合愈伤组织进行遗传转化，诱导出AGPase转录后表达量下调的转化植株。研究百合淀粉合成代谢途径中AGPase基因的调节功能，为该基因功能的进一步探究及今后百合组培鳞茎膨大繁育基因调控技术的开发提供了材料与思路。