高效毛细管电泳法测定泳池中尿液指示物乙酰磺胺酸钾

韩燕祯，朱怀娇，石红梅,徐向东*

(1.河北医科大学 公共卫生学院，河北 石家庄 050017；2.河北省环境与人群健康重点实验室,河北 石家庄 050017)

泳池与公共浴池中人体尿液量是公共卫生关注的一个问题，尿液含量的高低反映了泳池的卫生状况。尿液不仅可传染某些疾病[1-2]，引发眼部红肿不适[3]，而且尿液中含有的尿素、氨、氨基酸和肌酐等多种含氮化合物，可与泳池消毒剂反应生成多种消毒副产物，这些产物达一定浓度时可对人体产生毒性或引起过敏、哮喘[4]，因此泳池水中尿液含量的监测对于公共卫生具有重要意义。

目前，我国通过检测泳池或公共浴池中尿素的含量来判断池水是否受到尿液污染。虽然此法符合公众在直观上的认识，但也存在严重缺陷：一是人体不仅通过排尿方式排出尿素，而且也以出汗的方式通过皮肤排泄尿素。有研究证实水中运动时，29 ℃以下水温中人皮肤出汗率为0.1～0.2 L·(m2·h)-1，水温35 ℃时出汗率升至0.8 L·(m2·h)-1，说明不能忽略经排汗产生的尿素。其次，由于加入池中的消毒剂多为液氯、次氯酸钙、次氯酸钠、三氯异氰尿酸钠等含氯化学品，会与尿素产生化学反应，生成三氯胺等[6-7]，影响对尿素的检测。因此，非常有必要寻找一种稳定、不与消毒剂反应且只通过尿液排泄的标志物，用于泳池或公共浴池中尿液污染的检测。

乙酰磺胺酸钾(Acesulfame-K,ACE)是一种广泛使用的人工合成甜味剂，又名安赛蜜，广泛应用于各种食品中[8]，其进入人体后完全以原形经尿液排出且形态稳定[9-10]。因为ACE只来源于人体尿液，具有代表性和特异性[11-13]，近年来，加拿大、英国、美国等国的研究人员以水样中ACE的检测浓度来推算尿液的含量。人体排出的尿液经泳池水的极大稀释后其中的ACE浓度很低。此外，人体皮脂、汗水、尿液排放等对池水造成的污染，以及化学消毒剂与其消毒副产物，为复杂的泳池水中极微量ACE的检测带来了挑战。

目前，游泳池水中ACE的检测方法有高效液相色谱-质谱联用法[13-14]和离子色谱-质谱联用法[15-16]。但质谱仪价格昂贵，样品处理复杂，应用受到限制。高效毛细管电泳法是20世纪80年代以来发展最快的分析方法之一，其以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异实现分离分析，具有分离效率高、运行成本低、绿色环保等优点[17]。尚未见采用毛细管电泳检测泳池水中ACE含量的文献报道。本研究建立了一种泳池水中ACE的检测方法，采用固相萃取法简单处理样品，通过毛细管电泳分离检测，为泳池水中ACE的检测提供了灵敏、简便、经济实用的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

P/ACETMMDQ高效毛细管电泳仪(配DAD检测器和32Karat数据处理软件，上海爱博才思分析仪器有限公司)；无涂层熔融石英毛细管(60.2 cm×75 μm，有效长度50 cm，河北永年县锐沣色谱器件有限公司)；隔水式培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；纯水器(四川优普超纯科技有限公司)；pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；Labnet 旋涡混匀器VX-200(上海京工实业有限公司)；Oasis®HLB 固相萃取小柱(500 mg/6 mL,美国Waters公司)。

ACE标准品(北京索莱宝科技公司)，用超纯水配制成1.0 mg/mL的标准储备液，4 ℃冰箱保存待用；硼砂、硼酸、氨水、氢氧化钠(分析纯)，盐酸(优级纯)，均购于北京化学试剂厂；甲醇(色谱纯，Honeywell Burdick & Jackson公司)；实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

以10 mmol/L硼砂溶液(0.1 mol/L NaOH调至pH 9.3)为电泳缓冲液，紫外检测波长为226 nm，采用压力进样，进样时间20 s,在24 kV恒定电压，25 ℃柱温下进行电泳。每次实验前依次用1 mol/L的NaOH冲洗20 min，水冲洗5 min，运行缓冲液冲洗10 min。每两次进样间用1 mol/L NaOH、水和运行缓冲液各冲洗1 min。

1.3 样品处理

将30 mL游泳池水样用0.22 μm滤膜过滤后，过Oasis®HLB 固相萃取小柱(预先用6 mL甲醇和6 mL水活化)，用3 mL 1.0× 10-4mol/L(pH 4.0)的盐酸淋洗，真空抽干，用5 mL 含5%氨水的甲醇洗脱，收集洗脱液，于60 ℃氮气吹干后，用250 μL水复溶。混匀后直接进样检测。

2 结果与讨论

2.1 测定波长的选择

将ACE标准溶液在190～300 nm范围内进行波长扫描，观察到ACE在226 nm处有最大吸收，因此选择最佳检测波长为226 nm。

2.2 缓冲溶液浓度的选择

考察了磷酸盐和硼酸盐两种缓冲体系，发现硼酸盐体系的出峰信号及峰形更好，因此选用硼酸盐体系对ACE进行分离检测。文献中毛细管电泳分离缓冲溶液的浓度一般至少为10 mmol/L才具备良好的缓冲容量，保证进样瞬间分离缓冲溶液的pH值和电导不改变[15-16]，因此本实验考察了硼砂浓度在10～50 mmol/L范围内的影响，发现随着硼砂浓度的增大，ACE的出峰时间延后，峰电流增大，峰高减小。综合考虑选择硼砂浓度为10 mmol/L。

图1 缓冲溶液pH值对峰信号值的影响Fig.1 Influence of pH value on ACE signal

2.3 缓冲溶液pH值的选择

以电渗流(EOF)为驱动力的毛细管电泳法，其EOF对缓冲溶液的pH值十分敏感。缓冲溶液的pH 值影响毛细管表面的Zeta电势，进而影响EOF的方向和大小；pH值也影响样品中各组分分子表面电荷数量，进而影响组分迁移速率及分离效果。因此，pH值对分离效果影响较大[18]。本实验考察了硼砂缓冲溶液pH值在8.3～10.0范围时对ACE出峰信号、时间、峰高及峰形的影响(图1)。由图1可知，缓冲溶液的pH值为9.3时，峰高值最大，且电泳图谱中峰形较佳。因此选择pH值为9.3。

2.4 分离电压的选择

分离电压是分离的动力，决定电场强度，进而影响 EOF 大小及带电粒子迁移速率，从而决定组分迁移时间。通常电压升高，电泳和电渗速度增加，样品分析时间缩短。本实验考察了不同分离电压(18～29 kV)对ACE迁移时间的影响，结果表明分离电压越高，迁移时间越短。当分离电压为24 kV时，迁移时间较短，峰高值较大，峰形较好，因此实验选择24 kV作为分离电压。

2.5 进样时间的选择

本方法采用压力进样法，考察了不同进样时间(5、10、15、20、25、30 s)对测定的影响。结果表明：延长进样时间会增加进样量，导致峰高值增大，但过长的进样时间会导致峰展宽，峰形变差，出现拖尾现象。实验最终选择进样时间为20 s，此时可以获得合适的峰形。

2.6 线性范围、检出限与精密度

吸取适量标准储备液，用水稀释成质量浓度分别为0.2、1.0、2.5、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的系列溶液,在最佳电泳条件下测定，以峰高(y)对相应质量浓度(x，mg/L)进行线性回归。结果表明，ACE在0.2～100.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=1.114x+0.04，相关系数(r)为0.999 8，检出限(LOD，S/N=3)为50.0 μg/L。对10 mg/L ACE标准溶液连续进样7次，计算得到迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)分别为0.73%和1.8%。

图2 泳池水样与加标后毛细管电泳图Fig.2 Capillary electrophoresis chromatograms of sample and standard addition

2.7 样品分析及加标回收率

在优化实验条件下，样品及样品加标后的电泳谱图见图2。由图可见，经过固相萃取富集纯化后，ACE与样品基质中的其他物质实现了良好分离。为验证方法的可靠性，取其中1个样品平行测定3份，分别加入不同质量浓度(2.5、26.0、72.0 mg/L)的标准品进行加标回收率实验，每个质量浓度平行测定3次，得加标回收率分别为103.6%、100.5%和96.0%。

收集石家庄市不同泳池的21个水样，经0.22 μm滤膜过滤后，按“1.3”所述用Oasis®HLB固相萃取小柱浓缩富集120倍，在226 nm波长下采用毛细管电泳法在优化实验条件下进行分离检测，结果如表1所示。其中15份水样检出ACE，质量浓度为1.64～39.25 μg/L，所测泳池水中ACE含量高于文献报道中加拿大泳池水的ACE检测数据(0.03～7.11 μg/L)[13]。2016年的一项调查研究显示中国人尿液中ACE的平均含量为4 070 μg/L[18]。由于城市自来水中ACE的含量处于很低的水平(6～15 ng/L)[13]，因此可用人尿液中乙酰磺胺酸钾的平均含量来估计游泳池中的尿液量。

表1 实际样品测定结果Table 1 Analytical results of real samples

*no detected

3 结 论

乙酰磺胺酸钾在自来水和人尿液中广泛存在，可用作泳池和浴池中尿液排放的指示物。本文采用高效毛细管电泳法结合固相萃取技术，建立了游泳池水中ACE的测定新方法。该方法的加标回收率为96.0%～103.6%，迁移时间和峰高的相对标准偏差(RSD)分别为0.73%和1.8%，检出限为50.0 μg/L。方法灵敏、准确、可靠，适用于游泳池水中ACE的检测分析。通过ACE浓度可以估测泳池水中尿液的含量，从而为泳池水中尿液量监测提供了更为科学和准确的途径。