基于HPLC-TOF/MS与HPLC-MS/MS的养心氏片主要成分研究

王 静，蒋惠宇，张晶晶,张 华，彭孝军

(1.大连理工大学 化工学院，辽宁 大连 116024;2.精细化工国家重点实验室，大连理工大学，辽宁 大连 116024;3.北京市劳动保护科学研究所,北京 100054)

养心氏片是由黄芪、灵芝、党参、丹参、葛根、地黄、当归、淫羊藿、延胡索(炙)、山楂、甘草(炙)、黄连、人参 13 味中药组成的中成药，具有扶正固本、益气养血、通脉止痛等功效[1]。临床研究表明，养心氏片对心绞痛、冠心病、心力衰竭等疾病具有显著疗效[2-4]，可改善冠心病患者左心室收缩及舒张功能,降低超敏C反应蛋白水平，对冠状动脉具有保护作用[5-6]。养心氏片的临床应用安全性较高，不良事件发生率为0.17%[7-8]。作为复杂处方，养心氏片具有“多成分-多靶点-多途径”的作用特点[9]，但其心血管保护作用的机制尚未充分阐明，还必须依赖于养心氏片的主要化学成分构成；对其化学成分的解析是加强养心氏片质量控制和安全性、有效性的重要保障。目前针对养心氏片的分析，仅有运用UHPLC-Q-TOF/MS技术进行定性分析[9]或运用HPLC方法对单一指标成分进行定量分析的报道，Yang等[10]建立了养心氏片中葛根素含量的HPLC测定方法，测得3批次养心氏片中葛根素的含量为1.93～2.51 mg/片；Sun等[11]建立了养心氏片中黄芪甲苷含量的HPLC/ELSD测定方法，发现3批次养心氏片中黄芪甲苷的含量为0.024%～0.027%。目前，关于养心氏片多组分化学成分同时定性及定量的分析方法尚未见报道。本研究利用高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱(HPLC-TOF/MS)联用技术，快速鉴定养心氏片化学成分；并采用高效液相色谱串联三重四极杆质谱(HPLC-MS/MS)对其主要成分进行定量分析，从而建立了高效快速的养心氏片化学成分的定性定量分析方法，并对其质量进行了全面评价。

1 实验部分

1.1 仪 器

Agilent 6224型 TOF LC/MS系统，包括1290 Infinity LC系统和G6224A TOF MS系统(美国安捷伦公司)；AB SCIEX QTRAP®4500 LC/MS质谱系统(美国AB公司)；Shimadzu LC-20AD UFLC系统(日本岛津公司);Elmasonic S60H通用型超声波清洗仪(德国艾尔玛公司)；MS105DU型精密天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试 剂

黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、丹酚酸B、葛根素、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、小檗碱、表小檗碱、黄连碱、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、甘草苷(分析纯，99%，普菲德生物技术有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia有限公司)；甲酸(色谱纯，美国ACS恩科化学)。所有试剂均为分析纯以上，实验用水为超纯水(Milli-Q超纯水系统，美国密理博公司)。养心氏片共10批，批号分别为160115、161101、161215、170601、151102、170702、170701、170210、171213、171111。

1.3 色谱-质谱条件

1.3.1HPLC-TOF/MS分析条件液相色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；梯度洗脱程序：0～25 min，5%～35% A；25～45 min，35%～ 100% A；45～50 min，100% A；50～55 min，100%～ 5% A；55 ～60 min，5% A；流速0.2 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量为20 μL。质谱条件：双喷雾离子源(Dual ESI)，正/负离子扫描检测方式；毛细管电压为4 kV，碎裂电压为150 V；干燥气体温度为350 ℃，干燥气流速为 8 L/min，雾化气压力为35 psi。

1.3.2HPLC-MS/MS分析条件液相色谱条件：色谱柱为Waters XBridge®BEH C18(150 mm×4.6 mm,2.5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；梯度洗脱程序：0～10 min，25%～ 35% A；10～15 min，35%～100% A；15～20 min，100% A；20～21 min，100%～ 25% A；21～25 min，25% A；流速0.4 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量为10 μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正负离子切换扫描检测方式，动态多反应监测模式(Scheduled MRM)；离子化电压(IS)5.5 kV/-4.5 kV；温度为500 ℃；喷雾气(GS1,N2)压力为50 psi；辅助加热气(GS2,N2)压力为60 psi；气帘气(CUR)压力为20 psi；碰撞气(CAD)设为Medium。

1.4 样品溶液的配制

1.4.1对照品溶液的制备以甲醇为溶剂分别制备质量浓度为40 mg/L的黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、阿魏酸、表小檗碱、延胡索乙素、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1储备液；以甲醇为溶剂分别制备质量浓度为1 g/L的小檗碱、黄连碱、丹酚酸B、甘草苷和葛根素储备液。将以上储备液存于4 ℃冰箱中待用。分别吸取各储备液适量，制备混合对照品工作液。

1.4.2供试品溶液制备取养心氏片5片(批号161101)，去除糖衣，研磨成粉，过60目筛后，称取200 mg样品至200 mL容量瓶中，加入适量甲醇溶解，并超声提取30 min，冷却至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，取上清液过0.2 μm滤膜，滤液待分析。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的确定

考察了纯甲醇、纯乙醇以及不同比例的甲醇-水和乙醇-水对养心氏片中主要成分的提取率，结果表明纯甲醇具有最高的提取率。同时，超声(功率100 W，频率40 kHz)辅助可以提高提取率。因此，确定提取方法为甲醇溶液超声提取30 min。

2.2 色谱-质谱条件的选择

2.2.1色谱条件考察了分别以甲醇和乙腈为流动相有机相的分离效果，结果表明，有机相为乙腈时，两种分析方法的分离度均较理想，且在水相中加入0.1%甲酸后的色谱峰形优于加入5 mmol/L乙酸铵，因此本文选择乙腈-0.1%甲酸体系作为流动相。在HPLC-TOF/MS分析中，采用具有较高分离效率的ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)色谱柱进行分离，分析时间为60 min；在HPLC-MS/MS分析中，由于MRM模式具有较高的选择性和灵敏度，为缩短分析时间，提高定量分析效率，选择Waters XBridge®BEH C18(150 mm×4.6 mm,2.5 μm)色谱柱，在25 min内可完成定量分析。

图1 供试品的HPLC-TOF/MS总离子流图Fig.1 HPLC-TOF/MS total ion chromatograms of the sample solutionthe peak number denoted was the same as that in Table 1

2.2.2质谱条件样品化学成分复杂，具有不同的质谱行为，因此HPLC-TOF/MS采用正负离子分别扫描的方法。HPLC-TOF/MS分析中，正离子模式鉴定出22种化合物，负离子模式鉴定出24种化合物，共推测出30种化合物；在HPLC-MS/MS分析中，也采用正负离子切换扫描的模式。选择Scheduled MRM监测模式定量分析16种化合物，以提高分析效率和灵敏度，实现了多种化合物的同时测定，不同化合物在各自的通道被检测，且未产生相互干扰。

2.3 养心氏片化学成分的鉴定

“1.4.2”制备的供试品溶液经HPLC-TOF/MS分析，得到的总离子流图见图1。

根据总离子流图所得到的化合物精确分子质量信息，通过Agilent MassHunter Qualitative Analysis(B.06.00)软件在5×10-6的质量偏差范围内匹配分子式，并与文献报道进行比对，对各化合物进行初步鉴定，共推测得到30种化合物，详细信息列于表1。利用已有的标准对照品，鉴别出黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA等16种化学成分(图2)。以正离子模式下的30号峰和负离子模式下的27号峰为例介绍鉴别过程。峰30和峰27的保留时间分别为43.12 min和29.90 min，质荷比分别为295.133 3和829.458 6。

表1 养心氏片成分定性分析Table 1 The qualitative analysis of ingredient compounds in Yangxinshi tablets

图2 对照品的总离子流图
Fig.2 Total ion chromatograms of the reference substance the number denoted was the same as that in Table 1

利用Qualitative Analysis软件，限定误差<5 ×10-6，匹配可能的分子式，并对比参考文献中已知化合物的质荷比，确定峰30和峰27的分子式分别为C19H18O3和C41H68O14，加合峰分别为[M+H]+峰和[M+HCOO]-峰，与理论精确分子质量(295.132 9和829.459 1)和同位素分布情况进行比对，吻合良好(图3)，推测峰30和峰27可能为丹参酮ⅡA和黄芪甲苷。最后，根据丹参酮ⅡA和黄芪甲苷标准对照品的保留时间、精确分子量、同位素分布等信息，确定峰30和峰27为丹参酮ⅡA和黄芪甲苷。

2.4 养心氏片化学成分的定量分析

2.4.1线性关系将16种混合对照品溶液依次稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍，取各浓度的混合对照品溶液各10 μL注入液质联用仪，测定各化合物峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)、对照品质量浓度为横坐标(X，μg·L-1)，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数。同法逐级稀释，分别以信噪比(S/N)为3和10时的进样浓度确定检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，如表2所示。16种分析物的线性相关系数均不小于0.997，在一定范围内线性关系良好。LOD为0.039 1～78.1 μg·L-1，LOQ为0.156～312 μg·L-1。根据《中国药典》的规定：养心氏片中黄芪甲苷的含量不得少于50 μg/0.3 g,16种分析物的线性范围和定量下限均可满足养心氏片样品的分析要求。

表2 16种分析物的保留时间、线性关系、检出限与定量下限Table 2 Retention times(RT)，linear relations，limits of detection(LODs) and limits of quantitation(LOQs) of 16 compounds

(续表2)

CompoundRT(min)Linear range(μg/L)Regression equationrLOD(μg/L)LOQ(μg/L)Epiberberine(表小檗碱)11.3062.5～2 000Y=67 200X-34 0000.997 00.4880.976Tetrahydropalmatin(延胡索乙素)11.506.25～200Y=201 000X+188 0000.998 30.1950.781Lithospermic acid B(丹酚酸B)11.80625～20 000Y=38.4X-10 7000.997 478.1312Coptisine(黄连碱)12.45156～5 000Y=29 300X+2 0300.999 60.3050.610Icariin(淫羊藿苷)13.36156～5 000Y=161X+46 5000.998 51.222.44Berberine(小檗碱)15.28625～20 000Y=8 110X+88 0000.997 40.1520.610Ginsenoside Rb1(人参皂苷Rb1)15.4415.6～500Y=147X-1580.998 30.7811.56Astragaloside Ⅳ(黄芪甲苷)15.99156～5 000Y=18.6X+2 1100.999 19.7619.5Tanshinone ⅡA(丹参酮ⅡA)21.740.625～20Y=204 000X+36 4000.999 90.039 10.156

2.4.2精密度、稳定性、重复性及回收率取同一份供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果显示，16种分析物的相对标准偏差(RSD)为1.6%～3.8%，表明仪器的精密度良好。

取供试品溶液，分别置于4 ℃冰箱中0、2、4、8、12、24 h后进样，记录峰面积。结果显示，16种分析物的RSD为1.2%～3.4%，表明在24 h内供试品溶液的稳定性良好。

取同一批次药材(批号161101)，精确称取200 mg，共6份，按照“1.4.2”方法制备供试品溶液，准确吸取供试液10 μL进样，测定峰面积，计算含量。6份样品中，16种分析物的RSD为1.2%～3.7%，表明方法重复性良好。

精密称取已知各成分含量的样品200 mg，共6份，分别加入等量的对照品，按“1.4.2”方法制备供试品溶液，按“1.3”液相色谱-质谱条件进行测定，计算加标回收率。6份样品中，16种分析物的平均回收率为96.8%～103.8%，RSD为1.0% ～3.5%，表明该方法准确度良好。

2.5 实际样品的测定

分别称取10批次样品各200 mg，按“1.4.2”方法制备供试品溶液，按“1.3”液相色谱-质谱条件各测定3次，得相应色谱峰面积，代入回归方程，计算16种成分的平均含量(表3,RSD≤4.4%)。对10批次养心氏片中16种成分进行检测，含量高于1 mg/g 片芯的化合物有黄芪甲苷、丹酚酸B、葛根素、小檗碱和黄连碱。上述5种化合物均具有显著的抗炎、抗氧化等活性，体内外研究证明其具有心血管保护活性[12-15]。《中国药典》规定，养心氏片中黄芪甲苷的含量不得少于50 μg/0.3 g。根据本研究测定结果，10批次养心氏片中黄芪甲苷的含量均高于该标准，但不同批次样品中各成分的含量存在一定差异，如小檗碱和黄连碱不同批次的含量差异可达6倍，这可能源于药材在采摘、加工、炮制过程中产生的误差，进一步说明建立多指标成分同时测定的中药复方制剂质量控制方法的必要性。

表3 10批次样品中16种分析物的含量Table 3 Mean contents of 16 compounds in 10 batches

3 结 论

中药化学成分研究是中药现代化研究的基础，本文建立了基于HPLC-TOF/MS的定性方法和基于HPLC-MS/MS的定量方法，对养心氏片中主要成分同时进行了定性分析和定量分析。推断鉴定了养心氏片中30种成分，并对其中16种主要成分进行了HPLC-MS/MS定量分析。该方法操作简便、结果准确，重复性好，为提高养心氏片的质量控制提供了可行性方法，也为其药理研究和应用奠定了基础。该方法可作为中药中多组分同时定性和定量分析的参考方法。此外，养心氏片在临床上用于慢性心力衰竭等病症疗效显著，但其作用机理尚不明确，因此本文建立的HPLC-TOF/MS和HPLC-MS/MS方法对于建立养心氏片化学成分库，进而阐明养心氏片抗心衰作用的关键靶点和通路也具有重要意义。