固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定地表水中10种抗病毒药物

刘先军，罗 波，冯家力，曾 栋，李帮锐，陈东洋

(湖南省疾病预防控制中心，湖南 长沙 410003)

抗病毒药是一类用于预防和治疗病毒感染的药物[1]，可用于治疗流感，以及广谱病毒感染如艾滋病、疱疹、肝炎等[2-5]。这些药物最终会以原型或者代谢产物形式通过尿液或粪便排出体外，随着生活污水、医疗废水等排放进入污水处理系统[6-9]。然而，目前的污水处理系统只能去除部分药物[10]，对大多数药物的去除效果不佳，有的几乎未被去除[11]。而未被处理的药物会随着污水处理厂出水的排放再次进入环境水体甚至饮用水，造成污染。Peng等[12]在珠江三角洲的污水处理厂及地表水中检出阿昔洛韦，质量浓度分别为177～406 ng/L和114～205 ng/L。

Sanderson等[13]对典型水生生物(藻类、水蚤和鱼)的毒性预测结果显示，抗病毒类药物位列最具毒性的药物第8位；Schlüter-Vorberg 等[14]的研究证实，阿昔洛韦及其臭氧氧化产物可分别对大型蚤和绿藻产生明显的慢性毒理作用。另外，野生鸟类对抗病毒药物已产生耐药性[15]。因此，考察和了解环境中抗病毒类药物的存在水平和生态效应具有较强的科学意义。

目前有关环境水体中抗病毒药物的分析方法报道较少，已有报道主要采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11-12]，该方法特异性强、灵敏度高，是现阶段痕量分析中最主要的技术手段，Prasse等[11]采用固相萃取柱净化和液相色谱-质谱法(SPE/LC-MS/MS)对废水、河水及地下水中阿昔洛韦等10种抗病毒药物进行了分析，取得了较好的效果。但目前有关抗病毒药物更昔洛韦、恩替卡韦、替比夫定及金刚烷胺在环境水体中存在水平的研究尚未见报道。本研究选择伐昔洛韦、阿巴卡韦、恩替卡韦、齐多夫定、奈伟拉平、更昔洛韦、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韦和金刚烷胺10种抗病毒类药物为对象物质，利用固相萃取富集净化/液相色谱-串联质谱技术建立了地表水中10种抗病毒药物的分析方法，并应用于实际样品的分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters ACQUITYTM超高效液相色谱-Xevo®-TQ-S质谱仪(美国 Waters公司)、MassLynx V4.1工作站。Oasis HLB(500 mg，6 mL)、Oasis MCX(500 mg，6 mL)固相萃取柱(美国Waters 公司)；ISOLUTE ENV+(500 mg，6 mL)固相萃取柱(瑞典Biotage 公司)；GF/A玻璃纤维滤纸(美国Whatman公司);甲醇、乙腈(HPLC级，Dikma公司)；甲酸(HPLC级，Fluka公司)；氨水、盐酸(分析纯，国药集团北京化学试剂公司)。伐昔洛韦、阿巴卡韦、恩替卡韦、齐多夫定、奈伟拉平、更昔洛韦、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韦、金刚烷胺标准品(纯度均≥99%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

1.2 标准溶液的配制

精密称取伐昔洛韦、阿巴卡韦、恩替卡韦、齐多夫定、奈伟拉平、更昔洛韦、替比夫定、拉米夫定、阿昔洛韦和金刚烷胺对照品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加适量甲醇使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取上述各成分的对照品储备液适量，用甲醇分别制成混合标准溶液和标准中间溶液，避光于-18 ℃保存。

1.3 UPLC-MS/MS分析条件

1.3.1液相色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm)；柱温：40 ℃；样品温度：4 ℃；进样体积：10 μL。流动相：A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液，B为乙腈；流速为0.3 mL/min；梯度洗脱程序：0～1 min，99%A；1～2 min，99%～95%A;2～3 min，95%～70%A；3～5 min，70%～5%A；5～5.5 min，5%A；5.5～5.6 min，5%～99%A。

1.3.2质谱条件电喷雾电离，正离子模式(ESI+)；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：0.5 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：550 ℃；脱溶剂气流速：800 L/h；碰撞室压力：3.1×10-3mbar。10种抗病毒药物的质谱采集参数见表1。

表1 10种抗病毒药物的UPLC-MS/MS检测条件Table 1 UPLC-MS/MS acquisition parameters for antiviral drugs

(续表1)

CompoundRetention time/minMRM-transitions(m/z)Cone voltage/VCollision energy/eVAcyclovir(阿昔洛韦)2.23226.1>152.1*,226.1>135.13512,28Amantadine(金刚烷胺)3.86152.1>135.1*,152.1>93.13518,26

*quantitative ion

1.4 样品前处理

地表水样品于2017年4月5日取自湘江长沙段。水样经GF/A(0.45 μm)玻璃微纤维滤纸过滤，4 ℃保存，在24 h内进行处理。

取1 000 mL水样调至pH 7.0，以5～10 mL/min的速度通过预先用2 mL正己烷、2 mL丙酮、6 mL甲醇和6 mL超纯水活化的ISOLUTE ENV+固相萃取柱。上样完毕后，将小柱减压抽干，用6 mL甲醇-丙酮溶液(体积比50∶50，含0.2%甲酸)洗脱，洗脱液在微弱的氮气流下吹干，然后用甲醇-水(体积比50∶50)溶液定容至1.0 mL，涡旋混合1 min，于4 ℃以10 000 r/min离心10 min，取上清液用于UPLC-MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件的优化

由于MRM技术具有灵敏度高、重现性好等特点，因此，为实现对环境中目标化合物的痕量分析，本实验采用MRM进行检测。首先，在流动注射状态下，分别将0.1 mg/L的10种抗病毒药物的单标溶液在正离子和负离子模式下进行全扫描以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果表明：在正离子全扫描模式下，[M+H]+为最强峰，以其为准分子离子进行碰撞诱导解离，并对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂温度、碰撞能量等参数进行优化。

在流动相中加入少量甲酸能增加化合物在正离子检测模式下的电离效率，促进[M+H]+离子生成，因此正离子检测模式下测定的目标组分采用0.1%甲酸水溶液和乙腈作流动相，优化梯度洗脱条件。依据目标化合物的理化性质，比较了待测物在ACQUITY UPLC BEH C18、HSS T3及CORTECS C18色谱柱上的分离效果。结果显示，恩替卡韦、齐多夫定、奈韦拉平、更昔洛韦和替比夫定在BEH C18和CORTECS C18柱的响应和峰形比HSS T3柱好，且伐昔洛韦在BEH C18上的响应远高于CORTECS C18柱，因此实验最终选择BEH C18作为色谱分析柱。图1为质量浓度为5.0 μg/L 的10种抗病毒药物标准溶液的MRM色谱图。

2.2 固相萃取柱的选择

本实验采用固相萃取技术对水体中目标化合物进行富集和净化，选择反相固相萃取小柱Oasis HLB、ISOLUTE ENV+和阳离子交换小柱Oasis MCX进行比较，用加标为2 ng/L的1 000 mL超纯水溶液(pH值分别为2.0、4.0、7.0和10.0)评价其回收率。结果表明：10种目标物在HLB柱的回收率均低于50%，伐昔洛韦、齐多夫定、拉米夫定、阿昔洛韦和金刚烷胺的回收率低于10%，上样液pH值的变化对该结果影响不明显，这可能是因为目标物的极性过强，在反相HLB上保留弱所致；在MCX柱上，伐昔洛韦和阿巴卡韦的回收率分别为29%和21%，其他8种抗病毒药物的回收率均在50%以上，且pH 4.0时效果最佳；使用ISOLUTE ENV+柱时，目标组分的回收率为73.0%～119.0%，且pH 7.0时回收率最高，与文献研究结果基本一致[11]。这是因为ISOLUTE ENV+柱是一种超交联羟基聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物，利于从大量水样中吸附极性化合物。因此，实验最终选择ISOLUTE ENV+用于水样的富集净化(pH 7.0)。

2.3 线性范围与定量下限

根据10种抗病毒药物在质谱中响应的强弱配制不同浓度的系列标准溶液，在处理过的湘江水中加入不同浓度的标准溶液，配制成质量浓度分别为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/L的系列混合标准溶液，按“1.4”方法进行富集测定，分别以其峰面积(Y)对相应质量浓度(X，ng/L)进行线性回归分析，得10种目标物的相关系数r2>0.993，结合整个方法的富集倍数和回收率计算出该方法对地表水中目标化合物的定量下限(S/N=10)为0.2～5.0 ng/L(表2)。

2.4 回收率与精密度

取湘江水源水(总有机碳(TOC)为2.178 mg/L，pH 7.2 )加入适量的混合标准溶液，使目标化合物质量浓度分别为2、5、10 ng/L，按最优条件进行处理和测定(表2)，得到平均加标回收率为70.0%～104.0%，相对标准偏差(RSD)小于15%。方法的回收率与精密度可满足环境样品中痕量污染物的分析要求。

表2 地表水中10种抗病毒药物的线性范围、相关系数、定量下限、加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r2),limits of quantitation(LOQs),recoveries and RSDs of 10 antiviral compounds in surface water(n=6)

2.5 实际样品的测定

采用本方法对湘江长沙某段水源水3次采样样品进行检测，均检出阿昔洛韦、更昔洛韦和奈韦拉平(图2)，质量浓度分别为0.25～1.25、0.58～2.46、0.27～0.76 ng/L，阿昔洛韦的检测结果与Peng等[12]对珠江水的报道结果基本一致。实际样品中检出更昔洛韦和奈韦拉平可能与不同地区抗病毒药物的消费使用情况不同有关。

3 结 论

本研究采用ISOLUTE ENV+固相萃取柱浓缩净化和LC-MS/MS技术建立了同时检测地表水中10种常用抗病毒药物的分析方法，回收率和精密度均符合环境水样中痕量污染物的分析要求。采用该方法对湘江水源水进行检测，检出阿昔洛韦、更昔洛韦和奈韦拉平3种药物。考虑到抗病毒药物的潜在毒性效应，应对此类药物在医疗废水及自然水体中的污染状况和环境行为做进一步研究。