加速溶剂萃取/液相色谱-串联质谱测定底泥中氯硝柳胺及其降解产物

廖且根，张大文，罗林广

(江西省农业科学院 农产品质量安全与标准研究所，江西 南昌 330200)

氯硝柳胺作为WHO推荐使用的杀螺药，可用于灭杀水生环境中尾蚴阶段血吸虫[1]，以及血吸虫的载体如钉螺[2]、斑马贻贝[3]和福寿螺[4]。此外，氯硝柳胺可以杀死能捕食鱼苗的鱼，在水和光照条件下能自发降解[5-6]，主要降解产物为5-氯水杨酸(5-CSA)和2-氯-4-硝基苯胺(2C4NA)[7]，氯硝柳胺可作为理想的清塘剂。氯硝柳胺及其降解产物对水生生物具有毒副作用[8-9]。长期反复使用将导致氯硝柳胺及其降解产物蓄积在底泥中，因此有必要建立底泥中氯硝柳胺及其降解产物的分析方法。

氯硝柳胺的测定方法有荧光法[10]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[11-12]、高效液相色谱法(HPLC)[13-14]和电化学方法[15-16]。荧光法、电化学方法简单，但易受干扰，仅适用于简单体系，如水样、药剂；高效液相色谱法因灵敏度不高而应用受限。液相色谱-串联质谱法的灵敏度和选择性高，对于底泥样品，仍需必要的前处理过程。底泥样品的常用提取方法为索氏提取法，但该法萃取时间长，有机溶剂消耗多，且需人工操作；更有效的自动提取技术，如加速溶剂萃取(ASE)得到了广泛应用[17]。然而，ASE技术对分析物的选择性较低，提取后样品需净化以除去同时提取的干扰物质[18]。通过在ASE萃取仪内放置足够的吸附剂可实现萃取和纯化同时进行，减少了事后除杂的需要，并允许净化步骤的自动化。该技术已应用于污泥和沉积物中一些新型和持久性污染物的分析[19-21]，常用吸附剂有硫酸化二氧化硅、C18和弗罗里硅土[22-24]。

本研究以中性氧化铝为池内吸附剂，加速溶剂萃取底泥中的氯硝柳胺及其降解产物。优化了提取溶剂及种类、温度、静态时间、吸附剂种类及与样品比例等加速溶剂萃取条件，并对实际样品进行了测试。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-1290Ⅱ-6495-MS/MS液相色谱-串联质谱仪(美国安捷伦公司)，ASE350加速溶剂萃取仪(美国戴安公司)。氯硝柳胺(NIC)、5-氯水杨酸(5-CSA)和2-氯-4-硝基苯胺(2C4NA)纯度分别为98%、99%、98.5%，均购自Sigma公司；甲醇(色谱纯，德国默克公司)；中性、酸性和碱性氧化铝、乙二胺-N-丙基(PSA)、弗罗里硅土、C18和硅藻土购于天津艾杰尔公司。实验用水为密理博纯水机(德国默克公司)制备的二次水。

1.2 实验方法

液相色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8 mm )；柱温40 ℃；流速为0.4 mL/min；进样量为5 mL。 流动相：A为水,B为甲醇。梯度洗脱条件：0～4 min,40% ～100% B；4～5 min，100% B;5～5.1 min，100%～40% B；5.1～6.0 min,40% B。

质谱条件:Agilent 6495三重四极杆质谱仪；ESI(-),毛细管电压3 000 V，多反应监测条件见表1。

表1 氯硝柳胺及其降解产物的质谱条件Table 1 MS conditions of niclosamide and its degradates

1.3 样品收集

所有底泥用抓斗式采泥器采集，含有40%～70%水分。底泥的理化性质参照文献[25]测定，采用pH 计测定底泥的pH值，重铬酸钾容量法测定有机质含量，乙酸铵法测定阳离子交换量(CEC)。测得所有底泥样品的pH值范围为 5.28～7.23，有机质含量为8.5～63.2 g/kg，CEC含量为80.6～203 mol/kg。样品经冷冻干燥后，磨碎、过筛，置于干燥器中室温保存。

1.4 样品提取与净化

底泥样品用ASE 350加速溶剂萃取仪进行萃取。在萃取池内依次填入5 g中性氧化铝、5 g底泥样品和6 g硅藻土混合物，采用乙腈和水(3∶1，体积比)混合溶液萃取，萃取液加入氯化钠饱和，液液分配后，转移萃取液有机相的1/2至100 mL鸡心瓶，旋转蒸发近干后，加入1.0 mL甲醇-水(4∶6，体积比)溶液溶解，过0.22 mm滤膜，待LC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 加速溶剂萃取条件的优化

氯硝柳胺及其降解产物在极性和溶解性上有较大差异，提取溶剂的种类和比率选择显得尤为重要。本实验选用乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、乙酸乙酯(EA)和水作为单一或组合溶剂，提取结果显示，采用单一溶剂提取时，其中1种或2种分析物的提取效率低，平均回收率低于60%，尤其是采用乙酸乙酯作提取试剂时，2-氯-4-硝基苯胺的回收率低于40%；而以乙腈-水组合溶剂提取时，回收率明显增加，5-氯水杨酸和2-氯-4-硝基苯胺的回收率均超过70%，当乙腈和水的体积比为3∶1时，氯硝柳胺及其降解产物的提取回收率最好，为80%～100%，因此实验选择乙腈-水(3∶1)为提取溶剂。

图1 温度对ASE萃取效果的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on recovery

温度是影响萃取效率的重要因素，升高温度能增加溶剂的渗透性，降低分析物在基质表面的吸附，从而提高萃取效率，但同时可能会导致分析物降解，引入更多共提杂质。实验考察了温度(60、80、100、120、140 ℃)对ASE萃取效果的影响，结果见图1。在60～100 ℃范围内，随着温度的增加，目标分析物的提取回收率均增加，100 ℃时5-CSA的提取回收率达105%，氯硝柳胺和2-氯-4-硝基苯胺的提取回收率达95%。之后继续升高温度，提取回收率反而降低，140 ℃时氯硝柳胺的提取回收率约下降10%，这可能是由于氯硝柳胺存在部分降解。因此，实验选择最佳萃取温度为100 ℃。

静态萃取时间和循环次数也是影响萃取效率的因素之一。实验对不同的静态萃取时间(4、 8、10、20、30 min)和循环次数(1、2、3次)进行了优化。结果表明，随着萃取时间从 4 min 增至10 min，提取回收率约增加9%，继续增加萃取时间，回收率反而降低，可能是共提的杂质干扰所致。循环2次比循环1次的提取效率约增加10.2%，继续增加循环次数，提取效率无明显增大，反而增加了样品前处理时间和共提杂质。因此，实验选择最佳的静态萃取时间为10 min，循环2次。

图2 吸附剂对净化效果的影响Fig.2 Influence of sorbent type on the recovery

池内净化是通过在提取前加入不同吸附剂来实现共提杂质的去除。实验分别考察了吸附剂种类(弗罗里硅土，中性、酸性和碱性氧化铝，C18，PSA)以及吸附剂与样品的质量比(1∶2、1∶1、3∶2)对萃取效率的影响，结果如图2所示。有水存在时，C18对氯硝柳胺有吸附作用，使得其提取回收率低于40%；而以PSA、酸性氧化铝和碱性氧化铝作为吸附剂时，5-氯水杨酸的提取回收率低于20%，可能是PSA和酸性氧化铝通过静电作用，而碱性氧化铝通过氢键作用吸附5-氯水杨酸所致。以中性氧化铝为吸附剂时，溶液更澄清，色谱峰信号显著增加，干扰峰少，表明吸附剂对杂质有移除效果；而弗罗里硅土对氯硝柳胺及其降解产物可能存在部分非特异性吸附，作为吸附剂时的提取效率均略低于中性氧化铝。随着吸附剂与样品质量比的增大，提取效率有所增加，当比例从1∶2增至到1∶1时，提取效率约增加10%，继续增大质量比，提取效率增加不明显。因此，实验选择中性氧化铝作为吸附剂，吸附剂与样品量的质量比为1∶1。

2.2 方法确证

在优化条件下，于空白底泥基质中加入氯硝柳胺及其降解产物标准溶液，其在0.1～20.0 μg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.999。以3倍和10倍信噪比计算得检出限和定量下限分别为0.04～0.1 μg/kg和0.2 ～0.5 μg/kg(表2)，优于目前已有方法对土壤中氯硝柳胺的检出限50.0 μg/kg[26]和定量下限30.0 μg/kg[27]，且已有文献方法不涉及对氯硝柳胺降解产物的分析。

表2 氯硝柳胺及其降解产物的检出限、定量下限、平均回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Limits of detection(LODs),limits of quantitation(LOQs),average recoveries and relative standard deviations(RSDs) of niclosamide and its degradates(n=5)

2.3 实际样品的测定

在优化条件下，对鄱阳湖及其周边池塘30个底泥样品中的氯硝柳胺进行分析，其中有5个样品检出氯硝柳胺残留，残留量为1.5～3.6 μg/kg，其余样品未检出氯硝柳胺及其降解产物。在未检出的底泥样品中，分别添加0.5、1.0、2.0 μg/kg 3个不同水平的氯硝柳胺及其降解产物储备液，按照优化的条件进行萃取和测定，结果见表2。3个加标水平下氯硝柳胺及其降解产物的平均回收率为 93.5%～101.9%,相对标准偏差(RSD，n=5)为3.7%～6.7%。加标样品(2.0 μg/kg)的色谱图见图3。

3 结 论

本文建立了加速溶剂萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定底泥中氯硝柳胺及其降解产物的方法。方法的检出限为0.04～0.1 μg/kg，回收率为93.5%～101.9%，相对标准偏差为3.7%～6.7%。结果表明，方法具有萃取效率高，灵敏度好等特点，可用于实际样品的分析。