李 仪,赵双丽,张 炎,何品刚,王清江
(华东师范大学 化学与分子工程学院,上海 200241)
大肠杆菌生长迅速,营养需求简单,是一种重要的工业微生物之一[1]。目前,大肠杆菌的代谢组学主要是研究遗传或环境扰动后生物体内小分子代谢物的变化情况,其代谢物主要有氨基酸、磷酸糖、有机酸、核苷等极性物质,其中氨基酸作为构成生物体蛋白质最基本的物质,占代谢物总含量的比例较高,因此准确测定大肠杆菌中氨基酸的含量具有重要意义[2]。
基于生物体基质复杂和代谢物含量低的特点,样品前处理是检测过程中不可缺少的重要环节[3]。生化样品中氨基酸的预处理方式主要有离心过滤[4]、分散液液微萃取[5]、选择性沉淀[6]、中空纤维膜液相微萃取[7]。其中,中空纤维膜液相微萃取的样品纯化能力好、富集倍数高、有机试剂用量少,而且中空纤维膜一次性使用,避免了交叉污染,提高了样品测试结果的准确度[8],因此近年来日益得到重视。
常见的氨基酸分离方法有高效液相色谱法[9]、阴离子交换色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、氨基酸分析仪测定法[12]等,与之联用的检测方法有质谱检测[13]、电化学检测[10]、紫外检测(包括二极管阵列检测)[14]、激光诱导荧光检测[15]等。柱前衍生/高效液相色谱法因灵敏、快速而被广泛用于氨基酸的测定[16]。赵先恩等[5]采用原位超声辅助衍生分散液液微萃取技术结合UHPLC-MS/MS分析了阿尔茨海默病大鼠尿中氨基酸和单胺类神经递质及其代谢产物,所用质谱技术无需标准品和衍生化,但仪器较昂贵。荧光法检测氨基酸主要采用柱前衍生,衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)[17]、异硫氰酸苯酯(PITC)[18]、二硝基氟苯(DNFB)[19]等。氨基酸也可与乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)[14]反应形成氨基烯酮衍生物,该衍生物可用二极管阵列检测器检测。DEEMM作为衍生试剂,具有反应条件要求不高、反应迅速、衍生产物稳定等优点,且在衍生过程中可以完全降解过量的衍生试剂[20]。
在不同外界环境的影响下,大肠杆菌中的氨基酸含量和种类均会变化。本实验在Luria-Bertani(LB)培养基的条件下培养大肠杆菌,采用中空纤维膜液相微萃取/超高效液相色谱联用技术,以DEEMM为衍生试剂,建立了大肠杆菌中8种氨基酸的超高效液相色谱测定方法。本方法准确可靠,为大肠杆菌菌体中氨基酸的分析提供了新方法。
标准大肠杆菌菌株ATCC25922购于上海鲁微科技有限公司。UHPLC-30A超高效液相色谱仪(岛津公司),配二元泵、在线脱气和二极管阵列检测器;高压灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司);Q3/2 Accurel PP 聚丙烯微孔中空纤维膜(壁厚 200 μm,内径600 μm,孔尺寸 0.2 μm,多孔性75%)购自德国Membrana公司;KQ-2200DE超声清洗仪(昆山舒美超声仪器有限公司);高速离心机(上海卢湘仪有限公司);ME104E电子天平(梅特勒-托利多国际贸易有限公司);赛多利斯pH计(PB-10型,赛多利斯上海贸易有限公司);旋涡混合器(其林贝尔 VORTEX-5仪器制造有限公司);0.22 μm一次性微孔滤膜(北京芯硅谷科技有限公司)。
蛋白胨与酵母膏购于北京奥博星生物技术有限公司。氨基酸对照品:L-赖氨酸(Lys)、L-丝氨酸(Ser)、L-色氨酸(Trp)、L-酪氨酸(Tyr)、L-谷氨酸(Glu)、L-谷氨酰胺(Gin)、L-苯丙氨酸(Phe)、L-天门冬氨酸(Asp)。甲醇和乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。衍生试剂乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)购于阿拉丁生化科技股份有限公司,实验用水为超纯水。
硼酸盐缓冲液(pH 9.0):称取0.618 3 g硼酸,加9 mL水使其溶解,用1 mol/L的NaOH溶液调至pH 9.0后,加水稀释至10 mL,得到1 mol/L硼酸盐缓冲液。
醋酸盐缓冲液(pH 6.7):称取1.025 g醋酸钠,加水至450 mL,用冰醋酸调至pH 6.7,然后加水稀释至500 mL,得到25 mmol/L醋酸盐缓冲溶液。
标准溶液:分别准确称取1 mmol的Lys、Ser、Trp、Tyr、Glu、Gin、Phe、Asp标准品,用0.1 mol/L盐酸定容至10 mL(其中Tyr用0.1 mol/L NaOH溶解),得到8种氨基酸的0.1 mol/L标准储备液,于4 ℃冰箱保存。
配制LB液体培养基150 mL于锥形瓶中,灭菌。取冻存的大肠杆菌接种到锥形瓶中,37 ℃摇床培养24 h。将菌体与培养基分离后,加入灭菌后的蒸馏水,以8 000 r/min离心6 min,弃去上清液。之后再加入灭菌后的蒸馏水,重复以上操作1次,得到大肠杆菌菌体。在含有菌体的离心管中加入1 mL 50%甲醇溶液,旋涡混匀后,于-20 ℃下放置15 min后取出,于37 ℃水浴中放置15 min,旋涡混合,重复上述冻融过程2次。再以8 000 r/min离心6 min,取上层清液进行衍生。
氨基酸的DEEMM衍生参照文献[20]方法。准确吸取不同浓度的标准溶液或大肠杆菌菌体提取液200 μL,加入350 μL 的1 mol/L硼酸盐缓冲液(pH 9.0)、150 μL甲醇和3 μL的DEEMM衍生试剂,于30 ℃下超声45 min。然后于70 ℃下加热2 h,经0.22 μm滤膜过滤后待萃取。
色谱柱为Shim-Pack GISS C18(2.1 mm×100 mm,1.9 μm),流速为0.2 mL/min,柱温为25 ℃,流动相为体积比45∶55的甲醇-25 mmol/L醋酸盐水溶液(pH 6.7),最佳吸收波长为280 nm,进样量为10 μL。
将中空纤维膜剪成长度约5 cm,置于丙酮中超声清洗10 min后在通风橱中自然风干,热封一端后,将接收液注入中空纤维膜,热封另一端,使中空纤维膜处于“封闭”环境。最佳萃取条件为:给出相体积8 mL,其中盐酸浓度为5.0 mmol/L,NaCl质量浓度为200 g/L;接收相体积为8 μL,NaOH 浓度为0.3 mol/L;液膜(SLM)为正辛醇;萃取温度为25 ℃;搅拌速度为500 r/min;萃取时间为4 h。
图1 8种氨基酸的高效液相色谱图Fig.1 Chromatogram of eight amino acids standard solution by UHPLC1.Asp;2.Glu;3.Ser;4.Gin;5.Phe;6.Lys;7.Tyr;8.Trp;c=14.0 μmol/L
实验对流动相的种类、有机相含量以及水相的pH值进行了优化。对于UHPLC检测,通常在水中加入甲醇和乙腈等洗脱能力较强的溶剂。分别考察了体积分数为25%、35%、45%、55%的甲醇或乙腈作为流动相时对氨基酸分离的影响。考虑到氨基酸为两性物质,不同缓冲液pH值会对其离解程度有影响,从而影响氨基酸的保留值,实验考察了流动相水相(25 mmol/L醋酸盐水溶液)的pH值分别为6.1、6.3、6.5和6.7时8种氨基酸的分离效果。实验结果表明,当甲醇为45%,25 mmol/L醋酸盐水溶液的pH值为6.7时,8种氨基酸可在1~4 min内完全分离,标准谱图见图1。故本实验选择流动相为甲醇-25 mmol/L醋酸盐水溶液(pH 6.7)(45∶55,体积比)。
2.2.1接收相与给出相溶液浓度的优化氨基酸是两性电解质,其离子化过程分两步进行。因液相微萃取需通过调节pH值使被测物质在给出相中呈分子状态,才能通过中空纤维膜的有机相进入接收相中,所以接收相和给出相溶液的pH值非常重要。实验考察了接收相NaOH溶液浓度(0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mol/L)对氨基酸衍生物富集效率的影响。结果表明,8种氨基酸衍生物的富集倍数(EFs)在NaOH溶液浓度为0.30 mol/L时达最大,因此选择NaOH溶液浓度为0.30 mol/L。然后考察了给出相盐酸浓度(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mmol/L)对氨基酸衍生物的影响。结果发现随着给出相中盐酸浓度的增加,8种氨基酸衍生物的富集倍数(EFs)明显提高,当盐酸浓度为5.0 mmol/L时,继续增加盐酸浓度,各氨基酸衍生物的EFs开始下降。所以选择给出相盐酸浓度为5.0 mmol/L。
2.2.2NaCl浓度的优化由于分析物在有机溶剂和样品之间的分配系数受样品基体的影响,向样品溶液中加入NaCl等无机盐可增强溶液的离子强度。而盐析效应会降低待测物在样品中的溶解度,从而提高样品在萃取相中的分配,进而提高萃取效率。实验考察了NaCl的质量浓度在100~300 g/L范围内对萃取的影响。结果表明,8种氨基酸的EFs在NaCl质量浓度为200 g/L时达到最大,因此选择在样品溶液中加入200 g/L的NaCl。
图2 温度对富集倍数的影响Fig.2 Effect of the extraction temperature on EFs of eight amino acids compounds
2.2.3萃取温度的优化萃取温度对萃取过程有动力学和热力学的双重影响。在萃取过程中,当温度升高时,待萃取物质的质量传递系数增大,扩散速度加快,萃取效率随之提高。但萃取温度过高会加大有机溶剂在水中的溶解度,从而影响给出相和支撑液膜的稳定性,或导致给出相中的水分挥发过快,使得目标分析物的富集倍数不稳定。实验考察了萃取温度(20、25、30、35、40 ℃)对萃取效率的影响(图2),发现8种氨基酸的EFs在25 ℃时达到最大,因此选择25 ℃为最佳萃取温度。
2.2.4萃取时间的优化动态的三相HF-LPME是基于待测物在样品溶液与萃取相之间分配的过程,所以在萃取达到平衡时,待测物的萃取效率最高。一般而言待萃取物进入接收相溶液中的量随着萃取时间的延长而增加,直至某一平衡点达到最大值。本实验考察了萃取时间分别为2、3、4、5、6 h时8种氨基酸的萃取效率。结果显示,8种氨基酸的EFs在萃取4 h时达到最大。当萃取时间超过4 h时,接收相溶液的体积明显减少,且EFs明显降低。基于此,选择4 h为最佳萃取时间。
2.2.5搅拌速度的优化采用磁力搅拌能促进给出相的分散以及目标分析物的转移,缩短萃取时间,进而提高EFs。但搅拌过快会加速萃取溶剂分散到提取液中,从而降低萃取效率。当搅拌速度大于500 r/min时,给出相溶液出现涡流现象,中空纤维膜表面的有机相膜易被破坏,从而导致富集效率减小。实验考察了给出相的搅拌速度(200~500 r/min)对萃取效率的影响。结果表明,搅拌速度为500 r/min时,8种氨基酸的EFs达到最大值,因此选择500 r/min为最佳搅拌速度。
依据萃取后接收相中分析物的浓度和萃取前样品中分析物的初始浓度之比得到富集倍数。在“1.6”最佳富集条件下,中空纤维膜微萃取对8种氨基酸的富集倍数达110~290倍(见表1)。
2.3.1线性范围与检出限分别准确移取0.25、1.0、2.5、10、25 mmol/L的氨基酸混合标准溶液,按照本方法进行衍生化、萃取和分离测定。由表1可见,8种氨基酸在0.20~4.9×103μmol/L浓度范围内线性关系良好,相关系数r2均大于0.999。
在最优色谱分离条件下,将标准溶液进行稀释、分析,根据3倍信噪比得到相应的检出限(LOD)。由表1可见,8种氨基酸的检出限为0.08~0.35 μmol/L。该方法的灵敏度高,可以满足样品的测定要求。
表1 8种氨基酸的线性关系、相关系数、检出限与富集倍数Table 1 The linear relationships,correlation coefficients,detection limits and enrichment factors of eight amino acids
*y:peak area;x:mass concentration(μmol/L)
2.3.2稳定性、精密度、重复性与回收率取200 μL浓度为2.5 mmol/L的标准溶液衍生后,连续进样5次测定色谱峰的峰面积,计算8种氨基酸的相对标准偏差(RSD)为0.54%~3.3%(n=5);再将其衍生的标准品在室温放置12、24、36、48 h后进行测定,计算得RSD为0.19%~4.9%(n=5);取同一样品5份,经提取、衍生后测定色谱峰面积,得到RSD为0.32%~5.2%(n=5)。以上结果表明,该方法的精密度、重复性与稳定性较好,可用于大肠杆菌中氨基酸的分析检测。
同时对大肠杆菌样品进行加标回收实验,结果如表2所示,样品在5、10、50加标浓度下的回收率为88.7%~103.1%,RSD为3.2%~4.3%(n=5),表明提取溶剂的基质效应对分析物的定量分析影响较小。
表2 8种氨基酸的加标回收率及相对标准偏差(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of six sulfonamides(n=5)
图3 空白大肠杆菌样品(A)和大肠杆菌加标样品(B)的色谱图Fig.3 Chromatograms of the blank(A)and spiked(B,10 μmol/L) of the E.coli.1.Asp;2.Glu;3.Ser;4.Gin;5.Phe;6.Lys;7.Tyr;8.Trp
以DEEMM为柱前衍生试剂,在最优萃取条件下进行处理,采用UHPLC检测大肠杆菌中的氨基酸,空白样品和加标样品的色谱图见图3。结果表明,在大肠杆菌中均检出此8种氨基酸,Asp、Glu、Ser、Gin、Phe、Lys、Tyr和Trp的浓度分别为20.45、26.11、7.53、7.47、7.51、8.93、7.31、7.70 μmol/L,其中Glu的含量最高,其次为Asp。
本文通过对色谱条件和液相微萃取条件的优化,建立了一种中空纤维膜液相微萃取/超高效液相色谱测定大肠杆菌中8种氨基酸的方法。检出限、精密度、回收率等方法学的考察结果表明,本方法操作简单,灵敏度和稳定性高,适用于细菌中氨基酸的定量分析。