N-乙酰半胱氨酸对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症反应的抑制作用

彭晓东 冼 倩 杨春兰 庞浩文

(广东医科大学附属医院急诊科，广东 湛江 524001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种气流受阻且不可逆的慢性炎症疾病，目前研究发现炎症、氧化系统失衡、蛋白酶系统失衡是COPD发生的可能机制〔1〕。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一种临床上广泛使用的黏液溶解剂，目前可被用来治疗COPD，使患者痰黏液症状缓解，第1秒用力呼气量(FEV1)及50%肺活量时的呼气流速(MEF50)改善，但主要机制是通过提高机体抗氧化能力，降低氧化产物实现的〔2～4〕，而对于NAC是否能够通过抑制炎症反应来减轻COPD报道较少，本研究旨在探讨NAC对COPD大鼠炎症反应的影响及相关机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 50只约4周龄(200±20)g的SD雄性大鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证书：SCXK(沪)2012-0002，大鼠自由饮食和摄水。

1.2主要试剂及仪器 NAC购自美国Sigma公司，批号p12036；脂多糖(LPS)购自北京索莱宝生物技术有限公司；兔抗核转录因子(NF)-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体购自美国Abcam公司；肿瘤坏死因子(TNF)-α，白细胞介素(IL)-1β，IL-6，IL-8，基质金属蛋白酶(MMP)-2，MMP-9酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。ChemiDocTMXRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；ELX800酶标分析仪购自美国Bio-Tek公司。

1.3建模及分组 50只大鼠随机分为正常组，模型组，NAC低、中、高剂量组，每组10只。其中模型组及NAC采用烟熏+气管内滴加LPS复制COPD大鼠模型，具体操作参考相关文献〔5〕：两组大鼠置于已制作好的玻璃烟熏箱内，每天2次，每次30 min，每次间隔时间6 h，连续28 d，向烟熏箱内注入香烟烟雾。同时在第1、14天麻醉大鼠，沿着气管一次性缓慢注入200 μg/ml LPS，体积200 μl。正常组照常饲养。每天烟熏前30 min，NAC组分别灌胃给予50、100、200 kg·mg-1·d-1NAC，正常组及模型组给予等量生理盐水，连续28 d。

1.4支气管肺泡灌洗液(BALF)及标本的获得 第28天，用磷酸盐缓冲液(PBS)灌洗大鼠左肺支气管肺泡，离心灌洗液并重悬，部分灌洗液用于血细胞分析仪测量总白细胞数，部分灌洗液经涂片后，用Kwik-Diff染色法对中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞进行计数。另外将右肺组织取下并剔除脂肪组织清洗干净，用于细胞因子及蛋白的检测。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 将右肺组织标本固定24 h后，石蜡进行包埋，切片后，于二甲苯、梯度酒精、蒸馏水中脱蜡至水洗。苏木素染色，盐酸酒精分化，流水冲洗。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，于镜下观察。

1.6ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-2及MMP-9含量 取部分右肺组织，匀浆离心后，加入胰蛋白酶裂解，1 500 r/min离心10 min，收集上清液，后取上清液严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.7Western印迹检测NF-κB 信号通路相关蛋白表达 取肺组织标本，加入细胞裂解液裂解，离心收集上清液即总蛋白，并测定蛋白浓度。制作5%浓缩胶，12%分离胶，室温水封静置30 min。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，后湿法转膜。一抗溶液(兔抗NF-κB p65，p-NF-κB p65，IκBα，p-IκBα及GAPDH多克隆抗体，稀释度均为1∶100)孵育，4℃过夜；次日于二抗溶液室温孵育1 h。于凝胶成像系统中曝光。

1.8统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1NAC对COPD大鼠肺组织病理形态的影响 正常组肺组织结构完整，肺泡清晰完整，无炎性细胞浸润；模型组肺泡结构破坏，大量炎性细胞浸润；NAC组特别是高剂量组肺泡结构较为完整，炎性细胞浸润浸润较少。见图1。

图1 各组肺组织病理形态(HE，×200)

2.2NAC对COPD大鼠BALF中各类细胞数目的影响 与正常组比较，模型组中性粒细胞、单核巨噬细胞、淋巴细胞数及白细胞总数均显著提高(P<0.01)；与模型组比较，NAC低、中、高剂量组均显著下降(P<0.01)。见表1。

表1 各组BALF中各类细胞数目比较

与正常组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01;下表同

2.3NAC对COPD大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8含量的影响 与正常组比较，模型组TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8含量均显著升高(P<0.01)。与模型组比较，NAC低、中、高剂量组均显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组肺组织TNF-α，IL-1β，IL-6及IL-8含量比较

2.4NAC对COPD大鼠肺组织中MMP-2及MMP-9含量的影响 与正常组比较，模型组MMP-2及MMP-9含量均显著提高(P<0.01)；与模型组比较，NAC低、中、高剂量组均显著降低(P<0.01)。见表3。

2.5NAC对COPD大鼠肺组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组p-IκBα及p-NF-κB p65表达显著上调(P<0.01)；与模型组比较，NAC低、中、高剂量组p-IκBα表达显著下调(P<0.01)，NAC中、高剂量组p-NF-κB p65表达显著下调(均P<0.01)。见图2，表3。

A～E：正常组、模型组、NAC低、中、高剂量组图2 NAC对COPD大鼠肺组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

组别MMP-2(ng/ml)MMP-9(ng/ml)p-IκBα/IκBαp-NF-κB p65/NF-κB p65正常组0.18±0.020.35±0.030.08±0.010.06±0.00模型组7.53±0.751)8.42±0.841)0.57±0.061)0.38±0.041)NAC低剂量组5.64±0.562)6.13±0.612)0.32±0.032)0.38±0.04NAC中剂量组3.28±0.332)4.72±0.472)0.20±0.022)0.25±0.022)NAC高剂量组1.71±0.172)2.45±0.242)0.11±0.012)0.17±0.022)

3 讨 论

NAC是一种含有巯基的半胱氨酸衍生物，能够通过降解酸性蛋白多肽的二硫键，进而分解黏蛋白，最终降低痰的黏性，因此被应用于各种原因导致的肝损伤、肺损伤、重金属重度、心血管等的治疗〔2～4〕。反复烟熏联合2次气管滴入LPS是目前构建COPD大鼠模型最为常用的方法〔5〕，HE染色结果表明模型大鼠肺泡结构破坏严重，大量炎症因子浸润，说明造模成功。本研究结果表明NAC能显著改善COPD大鼠肺组织形态，减少炎症细胞浸润及 BALF中炎性细胞数目，提示NAC可能通过抗感染作用抑制COPD大鼠炎症反应。

在COPD过程中单核-巨噬细胞产生大量的TNF-α，IL-1β、IL-6及IL-8加重炎症反应〔6〕。且COPD过程中炎性细胞释放大量的MMPs，MMPs降解肺细胞外基质，使细胞壁变薄，黏液分泌增多，还破坏肺泡结构，使肺泡腔扩大，进而加重了COPD〔7〕。因此降低炎症因子水平及MMPs含量能一定程度上缓解COPD。另外NF-κB信号通路是一类能够与特异性κB位点结合的NF，在机体炎症反应过程中起重要作用〔8〕。生理条件下，NF-κB p65亚基位于细胞质，与IκB位点结合形成三聚体，不具有转录活性。在受到LPS等外界信号刺激时，IκB位点被降解、磷酸化、三聚体解离，p65进入细胞核，进而调控相关基因表达，而且研究显示NF-κB在COPD中活性显著上升，且NAC对NF-κB p65活性具有抑制作用〔9〕。综上，NAC能显著改善COPD大鼠肺组织形态，减少炎症细胞数目，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-2，MMP-9含量，可能与阻断NF-κB信号通路有关。