重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜免疫屏障的变化及甘露糖的干预效果

姚金锋 白 婧 郭 昱 崔东来

(河北医科大学第二医院消化内科，河北 石家庄 050000)

重症急性胰腺炎病理变化复杂，病情比较危重，死亡率较高〔1,2〕。重症急性胰腺炎的炎症反应除损害胰腺组织外，对邻近组织器官也有损害作用。肠道黏膜屏障由生物屏障、化学屏障、免疫屏障和机械屏障构成，是维持机体内环境稳定的重要屏障，可以防止肠道内病原体和有害物质进入体内。急性胰腺炎时肠黏膜上皮细胞膜和细胞之间的机械屏障被破坏，从而引起肠黏膜屏障损伤〔3,4〕，但急性胰腺炎引起肠黏膜屏障损伤的机制尚不十分清楚。甘露糖具有抑制伤口愈合处炎症反应及抑制中性粒细胞氧化爆发的作用。本文对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜免疫屏障的变化情况进行研究，并对其给予甘露糖治疗，观察甘露糖对重症急性胰腺炎大鼠肠黏膜屏障损害的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：清洁级、雄性、SD大鼠30只，体重270～310 g，实验前常规饮水和进食。主要试剂和仪器：牛磺胆酸钠、D-甘露糖(美国Sigma公司)，大鼠分泌性免疫球蛋白(sIg)A放射免疫分析试剂盒、大鼠甘露糖结合凝集素(MBL)酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒、大鼠白细胞介素(IL)-4 ELISA试剂盒(上海西塘生物有限公司)等。

1.2实验方法

1.2.1分组 将30只大鼠随机分为假手术组、胰腺炎组(重症急性胰腺炎组)和甘露糖组(重症急性胰腺炎+甘露糖干预组)，每组10只。

1.2.2重症急性胰腺炎模型的建立 采用戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔内麻醉，麻醉成功后常规备皮消毒，取各大鼠上腹部正中切口进入腹腔，分离胆胰管并结扎胆胰管肝门端。暴露并分离胆胰管十二指肠端，胆胰管内进针动静脉留置针，结扎后拔除针芯，向胆胰管内以0.2 ml/min速度注射3%牛磺胆酸钠(0.1 ml/100 g)，见胰腺肿胀坏死后向空肠内注射氯化钠溶液，0.5 ml/100 g，然后拔出穿刺针，逐层关腹。甘露糖组大鼠在重症急性胰腺炎模型造模成功后经尾静脉注射10%D-甘露糖。假手术组大鼠仅开腹、翻动胰腺和肠管、穿刺、关腹。

1.2.3标本制备 三组大鼠术后均经背部皮肤补液，术后12 h麻醉各组大鼠，进腹后经下腔静脉穿刺采血用于内毒素、淀粉酶、瘦素水平和sIgA、MBL、IL-4水平测定，取材胰腺和回肠末端进行相应检查。

1.2.4胰腺组织和回肠末端组织的病理学检查 进腹后，肉眼观察胰腺及腹腔各脏器的大体变化情况。HE染色：将胰腺和回肠末端组织用甲醛固定，制备石蜡标本，常规进行HE染色，观察胰腺和回肠末端组织的病理学变化。

1.2.5胰腺组织和肠黏膜组织病理评分 胰腺组织根据水肿、坏死、出血及炎症细胞浸润情况评价病理损伤程度，每项分值为0～4分，各项分值总和为病理评分；肠黏膜病理评分：根据肠黏膜损伤评分方法对肠黏膜进行病理评分，肠黏膜绒毛正常为0分；绒毛顶端上皮下出现间隙伴毛细血管充血为1分；上皮下间隙扩大、固有层重度水肿、乳糜管扩张为2分；肠黏膜上皮层细胞变性坏死、固有层水肿明显为3分；上皮细胞层变性坏死、毛细血管充血扩张，固有层裸露为4分；固有层崩解、绒毛脱落为5分。

1.2.6血内毒素、淀粉酶、瘦素水平测定 采用改良鲎实验方法测定血内毒素水平；采用全自动生化分析仪测定血清淀粉酶水平；采用放射免疫法测定血清瘦素水平。

1.2.7血清sIgA、MBL、IL-4水平测定 采用放射免疫法测定血清sIgA水平；采用ELISA法测定血清MBL和IL-4水平。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件，多组均数比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD检验。

2 结 果

2.1三组大鼠术后情况 术后假手术组大鼠无死亡，状态良好，肌力正常，活动敏捷；胰腺炎组大鼠2只死亡，一般状态差，饮水进食差，精神萎靡，反应迟钝；甘露糖组大鼠1只死亡，一般状态尚可，饮水进食较胰腺炎组好，反应较胰腺炎组敏捷。

2.2三组大鼠大体病理变化 假手术组大鼠腹腔内器官正常，无腹水；胰腺炎组大鼠胃肠胀气比较明显，见大量淡黄色或淡红色腹水，胰腺呈暗红色，大片出血坏死，见皂化斑；甘露糖组大鼠胃肠胀气较胰腺炎组轻，胰腺呈暗红色，见片状出血坏死，偶见皂化斑。

2.3三组大鼠胰腺组织HE染色 术后12 h，假手术组大鼠见散在水肿细胞，偶见出血坏死，无炎症细胞浸润；胰腺炎组大鼠胰腺组织结构紊乱，间质弥漫性水肿，胰腺腺泡细胞较多坏死，见片状出血灶，有大量炎症细胞浸润；甘露糖组大鼠胰腺组织结构比较清晰，见区域性水肿，少量出血灶和坏死细胞，少量炎症细胞浸润。见图1。

图1 三组大鼠胰腺组织HE染色(×200)

2.4三组大鼠肠黏膜HE染色 假手术组大鼠肠黏膜绒毛和上皮形态完整，未见明显损伤；胰腺炎组大鼠肠黏膜固有层水肿，绒毛顶端脱落，形态不规则，肠黏膜上皮细胞坏死；甘露糖组大鼠肠黏膜固有层水肿较胰腺炎组轻，绒毛形态不规则和上皮细胞坏死较胰腺炎组轻。见图2。

图2 三组大鼠肠黏膜HE染色(×200)

2.5三组大鼠胰腺病理学评分和肠黏膜病理学评分比较 三组大鼠胰腺病理学评分和肠黏膜病理学评分比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中胰腺炎组和甘露糖组大鼠胰腺病理学评分和肠黏膜病理学评分均高于假手术组(P<0.05)，甘露糖组大鼠胰腺病理学评分和肠黏膜病理学评分低于胰腺炎组(P<0.05)。见表1。

2.6三组大鼠血清内毒素、淀粉酶、瘦素水平比较 三组大鼠血清内毒素、淀粉酶、瘦素水平比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中胰腺炎组和甘露糖组血清内毒素、淀粉酶、瘦素水平均高于假手术组(P<0.05)，甘露糖组大鼠血清内毒素、淀粉酶、瘦素水平低于胰腺炎组(P<0.05)。见表2。

表1 三组胰腺病理学评分和肠黏膜病理学评分比较分)

与假手术组比较:1)P<0.05;与胰腺炎组比较:2)P<0.05；下表同

表2 三组大鼠血清内毒素、淀粉酶、瘦素水平比较

2.7三组大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比较 三组大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比较差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中胰腺炎组和甘露糖组血清sIgA、IL-4水平均低于假手术组(P<0.05)，甘露糖组血清sIgA、IL-4水平高于胰腺炎组；胰腺炎组和甘露糖组血清MBL水平均高于假手术组(P<0.05)，甘露糖组血清MBL水平高于胰腺炎组(P<0.05)。见表3。

表3 三组大鼠血清sIgA、MBL、IL-4水平比较

3 讨 论

重症急性胰腺炎时多种原因均可引起肠黏膜屏障功能障碍，引起肠道内细菌移位，肠道内的内毒素和细菌进入血液循环后激活单核-巨噬细胞，释放大量的炎症介质和细胞因子，引起全身炎症反应综合征的发生。重症急性胰腺炎患者几乎都有不同程度的肠黏膜屏障功能障碍，随着病情的进展，可对肠道造成不可逆损伤，肠黏膜屏障功能障碍使肠道通透性增加，肠道内的内毒素和细菌穿过肠黏膜，浸入肠壁、门静脉、肠系膜淋巴结等部位，发生细菌易位〔5～7〕。重症急性胰腺炎时革兰阴性菌数量增加，附着在肠壁，释放大量内毒素，引起肠道屏障损伤〔8,9〕。瘦素具有广泛的生物学作用，胰腺组织中存在有瘦素受体，在急性胰腺炎中瘦素发挥重要作用，胰腺炎患者瘦素水平升高〔10,11〕。sIgA水平代表局部体液免疫功能，是黏膜局部免疫反应的主要抗体。sIgA主要在黏膜上层黏液中存在，和肝胆疾病、呼吸道疾病、消化道疾病、泌尿生殖道疾病等多种疾病有关。在肠道内，sIgA能够抵抗蛋白水解，参与消化道黏膜防御作用，sIgA水平下降表示局部免疫功能下降〔12,13〕。MBL由肝脏合成，为一种急性期蛋白，对吞噬和炎症具有调节作用，和多种感染性疾病、自身免疫性疾病的发生有关〔14,15〕。IL-4为细胞因子之一，可以增加sIgA的分泌，增加机体体液免疫功能。在肠道组织中IL-4来自肠道固有层，可以抑制炎性细胞活化，减少炎症因子释放，从而发挥抗炎作用〔16〕。本文结果发现：重症急性胰腺炎大鼠胰腺出现严重炎症反应，肠黏膜组织受到破坏，血清内毒素、淀粉酶、瘦素、MBL水平升高，血清sIgA、IL-4水平下降。可见，重症急性胰腺炎大鼠模型存在肠黏膜屏障功能障碍。

甘露糖是一种六碳糖，在糖代谢过程中磷酸化生成甘露糖-6-磷酸，是临床上唯一应用的糖质营养素，在机体内分布广泛，在肠、肝、视网膜、神经等部位均有分布，参与机体的免疫调节，抵抗细菌感染、抑制巨噬细胞炎症、促进伤口愈合而发挥抗炎作用。本文结果发现，甘露糖可以减轻重症急性胰腺炎大鼠胰腺炎症反应，保护肠黏膜免疫屏障，其保护作用可能和甘露糖刺激肝脏分泌MBL，从而增加sIgA、IL-4水平有关。