TSC1在膀胱尿路上皮癌中的表达及其临床意义

贾亚涛 邓 飞 李红飞 王艳波 姜凤鸣

(吉林大学第一医院泌尿外科,吉林 长春 130021)

膀胱癌是泌尿生殖系统中常见的恶性肿瘤，术后容易复发且预后较差。TSC1编码的错构瘤蛋白(hamartin)为肿瘤抑制基因，在细胞的生长、增殖、分化、迁移、凋亡等各方面发挥重要作用。研究发现TSC1的编码产物hamartin在膀胱癌的发生及发展过程中发挥着极其重要的作用〔1〕。本实验拟分析TSC1在膀胱尿路上皮癌组织中的表达及其临床意义。

1 材料与方法

1.1一般材料 选取吉大一院泌尿外科2014年1月至2016年1月行经尿道膀胱肿瘤电切术切除的病理切片51例，均经病理证实为膀胱尿路上皮癌。其中男36例，女15例；年龄≤60岁19例，>60岁32例；肿瘤直径≤3 cm 36例，>3 cm 15 例；病理分级(采用WHO2004年分级法)：低分级27例，高分级24例；临床分期(采用国际抗癌协会2002年TNM分期法)：Ta-T1期：42例，T2期：9例。另取5例经病理证实为正常膀胱组织的病理切片作为对照组，男3例，女2例，年龄≤60岁1例，>60岁4例。

1.2主要器材和试剂 主要器材：(1)石蜡切片机(上海华骏医疗器材有限公司)；(2)光学显微镜(上海点应光学仪器有限公司)；(3)冰箱(广东美的集团)；(4)自动摄像显微镜(深圳奥斯微光学仪器有限公司)；(5)微波炉(广东美的集团);(6)恒温水浴箱(江苏金环试验设备有限公司)；(7)10、100、1 000 μl微量加量器(上海高鸽工贸有限公司);(8)10、100、1 000 μl吸头(上海晶安生物科技有限公司);(9)100.5 ml及1.5 ml EP管(上海百千生物科技有限公司)。主要试剂：(1)一抗兔来源TSC1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；(2)SP免疫组化试剂盒(南京建成生物工程研究所)；(3)二甲苯(北京博奥森生物技术有限公司)；(4)乙醇(北京博奥森生物技术有限公司)；(5)无水甲醇(北京博奥森生物技术有限公司)；(6)30%过氧化氢(H2O2)(北京博奥森生物技术有限公司)；(7)苏木精染液(北京博奥森生物技术有限公司)；(8)封片胶(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3方法 (1)在石蜡标本的最佳部位切3张厚度均为2 μm的切片，制成标本。(2)用二甲苯常规对标本脱蜡、入水和抗原修复。染色前用磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡10 min。(3)把标本放入3%H2O2-甲醛中浸泡10 min，以便消除内源性过氧化氢酶的作用。(4)用PBS冲洗3次，每次2 min。(5)加一滴试剂A于组织切片标本上，孵育10 min。(6)倒掉或吸干液体。(7)每张切片加100 μl一抗，在4℃的湿盒内过夜。(8)用PBS冲洗标本3次，每次2 min。(9)加一滴试剂B于每张标本上,孵育10 min。(10)用PBS洗标本3次，每次2 min。(11)加一滴试剂C于每张切片,孵育10 min。(12)用PBS洗标本3次，每次2 min。(13)加一滴上述二氨基联苯胺(DAB)显色液于每张组织切片标本上，室温下显色2～5 min。 (14)用自来水充分冲洗。(15)苏木素复染。(16)组织切片经梯度酒精水干燥、透明、中性树胶封片、镜检。

1.4结果判定标准 TSC1在胞质中表达，呈棕黄色或棕褐色。根据阳性细胞的比例及着色程度进行综合评分，阳性细胞比例<30%为1分，30%～60%为2分，>60%为3分；细胞着色程度：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。根据阳性细胞比例和细胞着色程度的乘积进行统计分析：0～1分为阴性，≥2分为阳性。

1.5统计学分析 使用SPSS19.0统计软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1TSC1在膀胱癌及正常膀胱组织中的表达 在细胞质中出现弥漫分布的棕褐色或棕黄色颗粒即为TSC1表达阳性，见图1。在膀胱癌组织中，30例(58.8%)呈阴性表达；而在正常膀胱组织中，均见TSC1正常表达；两组差异有统计学意义(χ2=6.335,P=0.012)。

2.2TSC1 在膀胱癌组织的表达与临床病理特征的关系 TSC1表达与临床分期、病理分级有关(P<0.05)，与性别、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)。见表1。

2.3TSC1的表达与膀胱癌复发的关系 术后随访18～36个月，随访45例复发19例。在膀胱癌组织中，复发组TSC1阴性表达率〔14例(73.7%)〕明显高于非复发组〔10例(38.5%)，P<0.05〕。

图1 TSC1在膀胱尿路上皮癌组织中的表达(×400)

临床病理特征n阴性表达(n=30)χ2值P值临床分期 Ta-T1期4222(52.4)4.0780.043 T2期98(88.9)病理分级 低分级2712(44.4)4.8980.027 高分级2418(75.0)性别 男3621(55.3)0.120.912 女159(69.2)年龄 ≤60岁1911(57.9)0.110.917 >60岁3219(59.4)肿瘤大小 >3 cm159(60.0)0.120.912 ≤3 cm3621(58.3)

3 讨 论

尽管约75%的膀胱癌患者在首次诊断时属于早期肿瘤〔2，3〕，但50%～70%的膀胱癌患者会在术后1～2年内复发，且20%的复发肿瘤最后会进展为肌层浸润性膀胱癌〔4〕。根据其复发和进展的风险，膀胱癌患者可分为低危、中危、高危人群〔5〕。研究发现，70%膀胱癌患者涉及某种特定基因的突变〔6〕，TSC1是与膀胱癌密切相关的肿瘤抑制基因〔7，8〕。TSC1基因发生突变导致其转录产物所编码的hamartin截断,翻译的过程被提前终止，从而引起hamartin功能缺失或障碍,其稳定马铃薯蛋白及防止其变性的功能减弱甚至消失,调节细胞骨架过程的作用减弱,引起TOR不受调控和持续激活,对细胞周期的抑制作用随之减弱,从而引起细胞异常黏附、生长及迁移,造成细胞的异常生长和过度增殖,最终导致肿瘤的发生。Edwards等〔9〕研究发现TSC1发生基因突变的膀胱癌患者会在更短的时间内复发。hamartin表达减少或降低的膀胱癌患者其发生进展的风险也更高，Mhawech-Fauceglia等〔10〕发现hamartin通过上调 p27 和14-3-3σ调节细胞的增殖过程参与膀胱癌的形成，从而推测hamartin可能用作预测膀胱癌的进展新指标。本实验结果与Edwards等〔9,10〕研究结果较为一致。TSC1基因参与细胞周期的调控,其编码的hamartin在胰岛素信号通路中是关键环节,该通路在许多恶性肿瘤中异常激活,为此可为膀胱癌的有效治疗提供新的靶点。定性定量的测定TSC1基因在膀胱癌组织的表达及突变情况,能够对研究膀胱癌的发生、发展、治疗、预后及转归提供重要的参考依据。