补肾方与补肾健脾方对快速老化模型小鼠肠和骨碱性磷酸酶蛋白的影响

张澜川 李 然 刘立萍

(辽宁中医药大学基础医学院，辽宁 沈阳 110032)

骨质疏松(OP)是一种与年龄密切相关的疾病，SAMP6快速老化小鼠是一种研究老年性骨质疏松(SOP)理想的动物模型，股骨及其他组织的病理改变与老年病理状态相似，可将其应用于SOP等老年性疾病的基础研究。肠钙吸收减少是SOP发生的重要因素之一〔1〕，十二指肠是参与肠钙吸收的主要场所〔2〕，十二指肠肠黏膜屏障功能的维护与肠碱性磷酸酶(ALP)密切相关。前期研究结果表明左归丸含药血清对成骨细胞(OB)增殖具有促进作用，并提高OB的ALP活性〔3〕。本研究拟分析补肾方与补肾健脾方对SAMP6快速老化模型小鼠十二指肠组织与股骨组织ALP蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取3月龄SPF级雄性未交配SAMP6快速老化模型小鼠24只，SAMR1同源对照小鼠8只，体重(30±2)g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物许可证号：SCXK(京)2011-0012。

1.2主要药物与试剂 补肾方左归丸组成：熟地黄24 g，炒山药、枸杞子、山茱萸、龟板胶、鹿角胶、菟丝子各12 g，川牛膝9 g。补肾健脾方左归丸合苓桂术甘汤组成：熟地黄24 g，炒山药、枸杞子、山茱萸、龟板胶、鹿角胶、菟丝子各12 g，川牛膝9 g，茯苓20 g，桂枝15 g，白术15 g，炙甘草10 g，均购于辽宁中医药大学附属第一医院，制备水煎剂。购自abcam公司的抗ALP抗体、博奥森公司的抗Ⅰ型胶原(Col1)抗体、Santa Cruz公司的抗β-Actin抗体。

1.3主要仪器 德国Leica石蜡切片机，日本OLYMPUS显微镜，美国Bio-Rad公司Trans-Blot SD半干转印系统，美国Protein Simple公司FluorChem Q蛋白质印迹成像系统。

1.4方法

1.4.1动物分组 实验分为SAMR1(对照组)、SAMP6(模型组)、补肾方和补肾健脾方4组各8只。

1.4.2给药与取材 补肾方与补肾健脾方给药剂量根据人与小鼠体表面积等效剂量折算，SAMR1与SAMP6给予等量水，1次/d，连续给药12 w，收集各组小鼠十二指肠组织和股骨组织。

1.4.3指标检测 采用苏木素-伊红(HE)染色法观察各组小鼠十二指肠组织形态，光学显微镜下观察和采集图像；采用Masson染色法，光学显微镜下观察股骨组织胶原形态和采集图像，Masson染色胶原纤维呈蓝色；采用Western印迹法检测股骨组织Col1蛋白表达水平；采用免疫组织化学(SABC) 染色法，光学显微镜下观察十二指肠与股骨组织ALP蛋白表达，SABC染色呈棕色至棕黄色染色区域为阳性表达区域。

1.5统计学方法 应用SPSS21.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1补肾方与补肾健脾方对SAMP6小鼠十二指肠组织形态的影响 对照组十二指肠组织小肠绒毛形成明显的叶状突起，表面上皮细胞完整，黏膜层形态完好，腺体较为完整，可见清晰的杯状细胞。与对照组比较，模型组十二指肠组织小肠绒毛形成的叶状突起破坏，肠绒毛缩短，表面上皮细胞受损，肠腺排列紊乱。与模型组比较，给药组小肠绒毛形成的叶状突起较为明显，肠腺排列较整齐，无明显细胞损伤。见图1。

图1 各组十二指肠组织形态(HE，×200)

2.2补肾方与补肾健脾方对SAMP6小鼠股骨组织胶原的影响 对照组骨小梁形态完整，股骨组织胶原面积染色较均一；与对照组比较，模型组骨小梁染色面积减少，胶原染色色淡且不均一；与模型组比较，给药组骨小梁染色面积均增加，骨小梁着色较均一，有少处着色不均，骨胶原含量明显增加。见图2。

图2 各组股骨组织胶原情况(Masson染色，×200)

2.3补肾方与补肾健脾方对SAMP6小鼠股骨组织Col1蛋白表达的影响 与对照组(0.94±0.06)比较，模型组股骨组织Col1蛋白表达(0.81±0.04)明显下调(P<0.05)，与模型组比较，补肾方组(0.91±0.04)与补肾健脾方组(0.93±0.02)显著上调股骨组织Col1蛋白表达(P<0.05)。见图3。

图3 各组股骨组织Col1蛋白表达

2.4补肾方与补肾健脾方对SAMP6小鼠十二指肠组织ALP蛋白表达的影响 对照组十二指肠组织ALP蛋白表达较多，阳性表达区域广泛，主要分布于柱状上皮细胞及肠腺细胞的胞质中。与对照组比较，模型组十二指肠组织ALP蛋白表达减少，阳性表达区域较小，肠上皮柱状上皮细胞损伤。与模型组比较，给药组可增加十二指肠ALP蛋白表达，阳性表达区域明显增加，给药组对ALP蛋白表达有较为明显的影响。见图4。

图4 各组十二指肠组织ALP蛋白表达(免疫组织化学染色，×400)

2.5补肾方与补肾健脾方对SAMP6小鼠股骨组织ALP蛋白表达的影响 对照组股骨组织ALP蛋白表达较多，在骨髓细胞中ALP有较为明显的表达，且主要表达于细胞质中。与对照组比较，模型组股骨组织骨小梁面积减少，骨髓腔面积增大，ALP蛋白表达明显的减少，阳性表达区域较小。与模型组比较，给药组可增加股骨组织ALP蛋白表达，阳性表达区域明显增加，在骨髓腔中和骨小梁骨细胞中均可见表达。见图5。

图5 各组股骨组织ALP蛋白表达(免疫组织化学染色，×400)

3 讨 论

SOP为低转换型原发性OP，与年龄密切相关。随年龄增长，伴随骨代谢激素分泌的转变与骨细胞功能下降〔4〕。SAMP6快速老化模型小鼠骨量减少，骨密度(BMD)降低，骨微结构被破坏，骨脆性增加，并伴有OB骨形成低下与破骨细胞骨吸收增强等特点，是研究SOP的理想动物模型〔5〕。SAMP6快速老化模型小鼠较同源对照SAMR1小鼠出现明显的骨矿含量升高及骨钙素水平降低，股骨生物力学性能低下〔6〕。本研究结果显示SAMP6快速老化模型小鼠股骨组织出现老化所致的骨小梁面积减少和骨髓腔增大等病理改变。

OP属中医“骨痿”和“骨痹”范畴，《素问·五脏生成篇》云：“肾之合骨也，其荣发也，其主脾也。”中医防治原发性OP，多以补肾为主，健脾为辅〔7〕。本研究结果显示补肾方与补肾健脾方可有效改善SAMP6快速老化模型小鼠股骨组织的病理改变。

导致OP发病的重要原因之一是小肠对钙离子吸收作用的下降，十二指肠是钙离子吸收的主要部位〔8〕。有研究表明衰老过程中，肠黏膜绒毛出现萎缩，隐窝变浅，肠黏膜完整性被破坏，小肠的消化、吸收、防御等正常生理功能呈现下降的趋势〔9〕。补肾中药可增强肠钙吸收功能〔10〕。本研究结果提示补肾方与补肾健脾方可有效改善衰老所致的肠上皮细胞损伤。Col1广泛存在于骨基质中，参与骨矿化过程和维持骨骼完整，在骨细胞形成与分化中起到重要作用〔11〕。前期研究结果表明补肾填精方左归丸可上调去卵巢大鼠股骨组织Col1蛋白表达〔12〕。本研究结果提示补肾方与补肾健脾方可能通过增加骨胶原含量，促进骨形成，改善SAMP6快速老化模型小鼠的OP病理状态。ALP广泛存在于人体各脏器组织中，包括肝脏、肾脏、骨骼、肠和胎盘组织中。老年女性多见ALP活性下降，可能与绝经后雌激素分泌减少有关，影响骨质的再吸收〔13〕。不同组织亚型的ALP有各自的特性，但所有的ALP都可以使底物去磷酸化。ALP的功能为参与骨骼的钙化及去钙化，肠ALP对维持肠道稳态有一定的作用〔14〕。ALP是骨形成和OB分化的标志〔15〕，SOP患者血清ALP升高，BMD与ALP呈负相关〔16〕。补肾法与补肾健脾法均可有效改善原发性OP患者成骨过程，降低血清ALP水平〔17，18〕。肠ALP是一种锚定于肠上皮细胞顶膜上的糖蛋白，在肠黏膜屏障的维护中发挥着重要作用〔19〕。肠黏膜屏障功能受损与临床多种疾病的发生发展有密切的关系，肠屏障功能障碍机制的研究对于临床相关疾病的防治有重要意义〔20〕。本研究结果提示骨形成能力低下，肠黏膜屏障功能受损，SOP的发生发展可能与肠黏膜屏障功能紊乱密切相关；补肾方与补肾健脾方可有效调节十二指肠和股骨组织中ALP蛋白表达，提高OB活性，促进骨形成。

综上，补肾方与补肾健脾方可有效改善SAMP6快速老化模型小鼠股骨组织骨小梁形态，增加股骨组织胶原含量和上调Col1蛋白表达，对SOP具有一定的防治作用；可改善SAMP6快速老化模型小鼠十二指肠组织肠黏膜损伤，上调十二指肠组织ALP蛋白表达。补肾方与补肾健脾方可能是通过保护肠黏膜组织，改善SAMP6快速老化模型小鼠OB功能，防治SOP。