糖尿病大鼠心肌组织中自噬基因微管相关蛋白1轻链3的表达

刘晓健 陈睿琦 胡 峰 张秀冰 曾庆红 王 艺 崔秀玲

(锦州医科大学药理学教研室，辽宁 锦州 121001)

自噬基因微管相关蛋白1轻链(LC)3是自噬的标志物，自噬形成时，胞浆型LC3(LC3-Ⅰ)会酶解掉一小段多肽，转变为自噬体膜型(LC3-Ⅱ)。研究表明在多种疾病的发生发展与治疗过程中均可有自噬水平的变化〔1,2〕。糖尿病(DM)心肌病是DM的重要并发症。Lee等〔3〕研究表明，持续的高糖环境心肌细胞出现明显自噬，可能促进DM心肌病的发生。而另有学者认为DM心肌中自噬不足促进了DM心肌病的发生发展，增强自噬可延缓心功能的损伤〔4,5〕。Xu等〔6〕报道心肌中自噬潮的减少是DM过程中的一种适应性反应，有自噬缺陷的DM心肌损伤反而减弱，增加自噬却加重了DM心肌损伤。Kanamori等〔7〕报道Ⅱ型DM小鼠心肌中自噬减少，而Ⅰ型DM小鼠心肌中自噬却增多。本研究探讨DM心肌损伤过程中自噬的变化。

1 材料与方法

1.1动物及模型建立 健康雄性SD大鼠125只(购自辽宁长生生物技术有限公司，SYXK(辽)2014-0010)，8周龄，体重(245±20)g。适应性喂养1 w后，对照组(NC组)49只注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；DM模型组(DM组)86只以尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)50 mg/kg，于注射后72 h测定空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol/L作为DM大鼠成模标准。造模成功72只，最终死亡8只，有1只出笼和16只因饲养过程中出现血糖回落于标准以下被剔除。饲养期间，所有动物自由饮水、进食，每周监测体重和尾静脉血葡萄糖等情况。两组分别在成模后第10、20、30、40、60、80、100天，以1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，结束动物饲养。

1.2心肌标本收集 麻醉状态下迅速取出大鼠心脏，预冷的生理盐水洗去血液，滤纸吸干水分，称量心脏重量，计算心重指数(心脏/体重，mg/g)。分离左心室组织，取部分心肌组织快速放入-80℃冰箱冻存，待测蛋白表达。另取一部分左心室组织放入新配制的4%多聚甲醛固定液中，待进行石蜡切片的形态学检测。

1.3心肌组织病理学检测 取石蜡包埋切片，行普通苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察两组各时间点心肌组织形态学改变。

1.4Western印迹检测蛋白表达 冰上操作眼科剪刀剪碎心肌组织后，加入含有1%蛋白酶抑制剂cocktail(美国Sigma公司)的RIPA裂解液(碧云天试剂公司)，超声碎裂组织后再在冰上裂解40 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min。取上清，二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量。与5倍样品缓冲液混合后,煮沸5 min。各个样品取等量总蛋白，经十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯凝胶中电泳后转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭2 h后,按预染Marker标记的分子量剪裁转印膜，分别加入甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(美国Santa Cruz公司)、LC3B抗体(美国Sigma公司)，4℃摇床孵育过夜。二抗(1∶8 000稀释)室温作用1 h后，电化学发光(ECL)法显色，GIS凝胶图像分析系统照相并分析处理。

1.5统计学处理 应用SPSS16.0软件进行ANOVA 和LSD检验。

2 结 果

2.1两组体重、FBG水平变化 DM组在造模后体重不再增加，甚至呈现明显减少，多食、多饮，多尿、时有稀便，毛色暗淡，病程达60 d后，个别大鼠开始出现眼睛发白，80 d后，多数大鼠有明显的眼睛白色变。NC组一切正常，毛色光亮，体格健康，无死亡，见表1。

2.2两组不同时期心重指数比较 随着鼠龄的增长，NC组心重指数稍有降低，而DM组明显升高。40 d开始，与同时间点NC组相比，DM组心重指数显著增加(P<0.01，P<0.05)，见表1。

2.3两组心肌组织形态学变化 NC组各时间点心肌组织的HE染色，在光镜下观察未见显著差别，心肌纤维走行整齐而致密。DM组在20 d时，心肌纤维走行基本整齐，与NC差别不明显；而在40 d时，偶见心肌纤维分布较疏松，走行稍有紊乱或呈收缩状改变；在80 d时，心肌纤维分布疏松和紊乱更为显著，见图1。

表1 两组体重、FBG、心重和心重指数比较

与同时间点NC组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

图1 两组心肌组织HE染色(×400)

2.4两组心肌组织中LC3-Ⅱ表达 NC组随鼠龄的增加，心肌组织中LC3-Ⅱ的蛋白表达呈现增多的趋势，10 d时1.00±0.00，20 d 1.11±0.11，30 d 1.11±0.08，40 d 1.27±0.12，60 d 1.49±0.08，80 d 1.52±0.12，100 d 1.58±0.15，从40 d开始与第10天差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。DM组随着病程的发展，LC3-Ⅱ的蛋白表达表现为先稍增加，10 d 1.00±0.00,20 d 1.06±0.07,30 d 1.08±0.07,40 d 0.93±0.07，但差异无统计学意义(P>0.05)，而后明显减弱，60 d 0.83±0.07,80 d 0.72±0.08,100 d 0.67±0.08(P<0.05,P<0.01)。与相同时间点NC组比较，DM组心肌组织中LC3-Ⅱ的蛋白表达在20 d时有增多趋势(1.00±0.00 vs 1.13±0.05)，但差异无统计学意义(P=0.059 7)；40 d呈现降低趋势(1.15±0.03 vs 1.10±

0.04)，较20 d差异有统计学意义(P<0.05)，至80 d时DM组(0.76±0.02)明显低于NC组(1.38±0.05，P<0.01)，见图2，图3。

图2 两组不同时间点心肌组织LC3-Ⅱ蛋白表达

图3 两组心肌组织LC3Ⅱ的蛋白表达比较

3 讨 论

据不完全统计，DM心肌病临床发生率约75%，但其发生机制尚未完全明了。目前研究认为，早期DM心肌病发生主要是由于线粒体损伤、细胞能量代谢异常、脂毒性、钙稳态失衡、细胞凋亡等机制参与，而氧化应激参与(DC)发生发展的各个环节〔7，8〕。

自噬过程是维持细胞合成、分解和结构重复利用必不可少的步骤。它不仅仅帮助细胞实现氨基酸的再循环，也帮助清除受损的细胞器，因而消除氧化应激，使细胞重塑而生存。LC3最初合成为未加工的形式pro-LC3，被转化成酶处理的形式LC3-Ⅰ，最终被修改成PE共轭的形式LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ是自噬小体结构可信赖的蛋白质标志〔9〕。

本研究结果显示，DM组心肌组织中LC3的蛋白表达显著减少，表明自噬水平降低，与近来较多研究结果一致〔4,6〕。本研究结果还显示，正常的大鼠随着鼠龄增长，心肌组织中LC3-Ⅱ的蛋白表达增多，与Xu等〔6〕报道不一致，可能与实验动物的种类和年龄不同有关。关于自噬水平在DM心肌病变中作用的不同结论，可能与不同龄的实验动物DM模型有关，Lee等〔3〕以幼年动物为实验对象，结果显示自噬促进了DM心肌病变的发展。

本研究结果提示随着DM的病程发展，心肌组织难以维持一定水平的自噬，可能正是由于自噬的明显减少，DM大鼠的心肌组织不能实现氨基酸的再循环及清除受损的细胞器，不能使细胞有效重塑，从而出现显著的心肌组织损伤。