雏菊叶龙胆酮对低氧诱导PC12细胞的保护作用及潜在机制

赵志英 高洋洋 高玉娟 高 黎 张 明 姜寒薇

(包头医学院麻醉学院，内蒙古 包头 014040)

缺血/低氧脑损伤是各种脑血管病发生发展形成的病理基础，缺血/低氧将直接引起脑损伤并导致级联病理生理损伤效应〔1〕。引起缺血脑损伤的主要机制之一是细胞凋亡，抑制神经细胞凋亡可减轻脑缺血损伤。尖叶假龙胆提取物具有保肝、抗氧化、抗感染、抗肿瘤等药理作用〔2〕。雏菊叶龙胆酮(Bellidifolin)是从龙胆科植物中分离提取的口山酮(Xanthones)类化合物，在植物中含量很高，且性质稳定。高黎等〔3〕发现，Bellidifolin对缺血性大鼠脑损伤，特别是局灶性脑缺血损伤具有显著的保护作用，且其保护作用的机制可能与抑制氧化应激，降低兴奋性氨基酸水平和增加γ-氨基丁酸(GABA)含量有关。也有研究发现Bellidifolin增加了睫状神经营养因子(CNTF)的释放，促进了坐骨神经损伤后的恢复功能〔3，4〕。细胞凋亡是多重信号分子的级联反应，在凋亡的启动和执行过程中需要某些蛋白、蛋白酶的参与。研究证明半胱天冬酶(Caspase)依赖性通路和非Caspase 依赖性通路于细胞凋亡时发挥重要作用〔5〕。其中Caspase-3是Caspase级联反应的最终执行者〔6〕，多种刺激因素启动的凋亡信号激活Caspase-3，切割下游的核酸酶、细胞骨架、蛋白激酶等，通过使细胞重要蛋白质降解失活，引起细胞形态改变导致细胞凋亡。有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路被各种细胞外信号激活，随后被磷酸化，涉及一系列生理和病理过程，包括细胞周期调控，细胞增殖和凋亡〔7〕。有研究认为细胞外信号调节激酶(ERK)通路激活主要是促进细胞存活和抑制凋亡，而JNK和p38MAPK通路的激活主要与细胞凋亡有关〔8，9〕。本文拟分析Bellidifolin对缺氧诱导神经元损伤的保护作用及潜在机制。

1 材料和方法

1.1材料 Bellidifolin(纯度>98%)购自四川维克奇生物科技有限公司。大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12)购于中国科学院上海细胞所。DMEM、RIPA裂解液和马血清购自美国Gibco公司。二氨基联苯胺(DAB)试剂盒购自福州迈新生物，兔抗p38MAPK、pERK、β-actin及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自美国Santa公司，其他试剂均购自美国Sigma公司。

1.2PC12培养及低氧模型制备 PC12培养于含5%马血清，5%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中贴壁培养。隔天换液，待进入对数生长期后用于后续实验。细胞分为未处理的对照组、低氧模型组、低、中、高剂量组(细胞用10、20、40 μmol/L Bellidifolin处理后低氧4 h，细胞放置在37℃孵育箱进行低氧刺激)。低氧刺激条件：低氧(1%O2、5%CO2、94%N2)6 h和常氧(21%O2、5%CO2、74%N2)8 h。

1.3细胞活力检测 取PC12，用DMEM培养液配成1×105/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，培养24 h，用不同浓度Bellidifolin(10、20、40 μmol/L)作用6 h后，低氧模型组和各给药组给予低氧刺激，培养24 h后用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞活性。测定570 nm处的吸光值，计算细胞存活率，每组设3个平行孔。

1.4Western印迹法检测Caspase-3蛋白表达 每组细胞收集后加入RIPA裂解液，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离裂解物(20 μg蛋白质)并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脱脂奶粉4℃封闭，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入一抗孵育过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G为第二抗体，室温孵育1 h，电化学发光法(ECL)显色，以β-Actin为内参，放入暗盒压片1 min后显影，定影。通过凝胶成像系统，进行蛋白表达量的半定量分析。

1.5免疫组织化学染色检测MAPK信号通路两种调控蛋白表达 取PC12爬片，按常规方法用4%多聚甲醛固定，进行免疫组织化学染色。免疫组化采用ENVISION二步法，正常山羊血清封闭，一抗4℃过夜(pERK抗体浓度为1∶200，p-p38MAPK抗体浓度为1∶500)。DAB显色液显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。空白对照切片以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。应用Image-pro plus5.0图像分析系统对免疫细胞化学染色阳性细胞进行OD值的测量。

1.6统计学分析 采用SPSS17.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1Bellidifolin对低氧PC12的影响 倒置荧光显微镜下见对照组PC12生长旺盛，多呈圆形或不规则形，胞核较大，胞体饱满、偶有扁平而长的突起，贴壁好。低氧模型组细胞结构破坏，表现为细胞贴壁性差，胞体皱缩，见大量细胞碎片和漂浮死细胞；而用不同浓度Bellidifolin作用6 h后，再进行低氧刺激，不同程度破坏了细胞形态，低剂量组破坏最严重，高剂量组细胞破坏最轻。见图1。

图1 5组细胞形态变化(×40)

2.2细胞存活率检测 低氧模型组PC12存活率(42.07%±2.97%)明显低于对照组(96.19%±2.41%，P<0.05)。与对照组相比，预先用不同浓度Bellidifolin作用6 h后，再进行低氧刺激，PC12损伤减轻，细胞存活率明显提高(P<0.05)，其中中、高剂量组细胞存活率(70.28%±4.00%，85.30%±2.45%)与低氧模型组、低剂量组(45.62%±4.83%)差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3Bellidifolin对低氧诱导PC12 pERK蛋白表达的影响 PC12经低氧处理后，pERK蛋白表达(OD值：7.31±0.65)略有降低，与对照组(7.74±0.41)及低、中、高剂量组(7.43±0.66、7.54±0.58，7.83±0.71)比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4Bellidifolin对低氧诱导PC12细胞p-p38MAPK蛋白表达的影响 与对照组(OD值：4.66±0.49)比较，PC12经低氧刺激6 h后，p-p38MAPK蛋白表达(7.46±0.52)显著增强(P<0.05)。预先用不同浓度Bellidifolin作用6 h后，再进行低氧刺激，PC12 p-p38MAPK蛋白表达显著降低(P<0.05)，其中中、高剂量组p-p38MAPK蛋白表达(5.70±0.40、5.37±0.37)与低氧模型组、低剂量组(7.32±0.42)差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 免疫组织化学检测各组细胞p-p38MAPK表达(×100)

2.5Bellidifolin对低氧诱导PC12 MAPK信号通路下游产物Caspase-3蛋白表达的影响 与对照组(1.00±0.06)比较，经低氧刺激6 h后，可引起MAPK信号通路下游凋亡关键因子Caspase-3在PC12中的表达(2.96±0.34)显著升高(P<0.05)。预先用不同浓度Bellidifolin作用6 h后，再进行低氧刺激，PC12 Caspase-3表达显著降低(P<0.05)，Caspase-3表达随着Bellidifolin浓度的增大逐步降低(P<0.05)，低、中、高剂量组分别为1.96±0.46、1.49±0.37、0.99±0.20，见图3。

图3 Western印迹检测各组细胞Caspase-3表达

3 讨 论

缺血性脑血管疾病均可导致不同程度的脑神经细胞缺血/缺氧。脑缺血/低氧损伤是引起中枢神经元凋亡的起始因素，其与脑血管痉挛、脑动脉硬化、血栓形成和出血有关〔10，11〕。低氧对大脑的直接损伤是各种脑血管疾病的始动环节。MAPK在神经系统疾病的发病机制中，对神经细胞的氧化应激反应、细胞存活起到关键性作用，通过连续的磷酸化调节信号分子把外部环境信号转导到细胞核及其他细胞内靶点，调控细胞增殖、分化、凋亡等多种细胞生物功能关键细胞信号转导通路〔12〕。在缺血/低氧条件下，线粒体通透性转变孔打开，促凋亡蛋白释放，并激活Caspase级联反应来触发细胞凋亡〔13〕。MAPK与缺氧/复氧(H/R)损伤密切相关，低氧提高p-p38MAPK及MAPK信号传导通路关键凋亡因子Caspase-3蛋白表达〔14〕。本研究证明低氧可导致PC12损伤，同时可降低细胞p38MAPK和Caspase-3蛋白表达。

细胞形态学变化表明，Bellidifolin对PC12低氧模型发挥了有利作用。40 μmol/L Bellidifolin预处理，再低氧刺激后，PC12形态破坏明显减轻，几乎完整，细胞数量增加。Bellidifolin具有浓度依赖性，两个较低浓度不能有效预防低氧导致的损伤。细胞存活率的数据再次证实，高浓度的Bellidifolin能够提高细胞存活率。本研究进一步发现，pERK通路不参与细胞低氧引起的细胞凋亡，但低氧引起p38MAPK蛋白质表达显著增加，p38MAPK通路参与细胞低氧引起的细胞凋亡，与Cui等〔14〕研究结果一致。说明Bellidifolin对抗低氧所致PC12损伤的能力与其降低p38MAPK和Caspase-3蛋白表达有关。Bellidifolin具有浓度依赖性，只有最高提取物量能有效恢复细胞活力、细胞形态和代谢控制水平。

综上，Bellidifolin可有效抑制低氧所致的PC12凋亡，其机制可能与抑制p38MAPK信号通路的活化及下游Caspase-3的表达有关。