低频重复经颅磁刺激对氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠海马CA3区PGP、MRP1、MVP表达的影响

赵安容 王 莉 余巨明 王圣之

(川北医学院神经疾病研究所，四川 南充 637000)

癫痫具有明显的反复发作倾向，严重影响患者的神经生物学、认知及心理功能，治疗仍以药物为主。近年来，尽管抗癫痫药物的研发及临床应用取得了相当大的进展，但仍有20%～30%的患者不能控制癫痫发作而成为难治性癫痫(IE)〔1，2〕。最新的研究提示，多药耐药蛋白(MDRP)过度表达可能参与了IE形成的机制，其中最受关注的MDRP包括P-糖蛋白(PGP)、多药耐药相关蛋白家族(MRPs)和主穹窿蛋白(MVP)/肺耐药相关蛋白(LRP)。低频重复经颅磁刺激(rTMS)对癫痫发作有明确的抑制作用，可降低癫痫患者的发作频率，改善脑电图〔3〕；动物实验亦表明，低频rTMS可以延长癫痫模型发作潜伏期〔4，5〕。本文拟观察低频rTMS对氯化锂-匹鲁卡品慢性癫痫大鼠海马内MDRP表达的影响，探讨低频rTMS的抗痫机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选取健康雄性SD大鼠60只，8周龄，体重210～230 g，平均(219.9±7.2)g，由川北医学院实验动物中心提供。按照随机数字表法分为对照组，模型组，假刺激组，治疗组，每组15只。

1.2主要仪器及试剂 仪器：MagPro R30型磁刺激器及MCF75环形线圈(Medtronic公司，丹麦)。

药品及试剂：匹鲁卡品(Sigma公司，美国)；东莨菪碱(Sigma公司，美国)；氯化锂(Amresco公司，美国)；PGP、MVP及MRP1兔抗大鼠多克隆抗体(北京博奥生物科技有限公司)；SABC、二氨基联苯胺(DAB)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3模型制备 慢性癫痫大鼠模型制备参照Glien等〔6〕及张小东等〔7〕的方法：1.5 mol/L氯化锂腹腔注射，剂量127.17 mg/kg；18 h后注射0.25 mg/ml东莨菪碱，剂量1 mg/kg；之后每隔30 min注射7.5 mg/ml的匹鲁卡品，剂量10 mg/kg，重复3～5次。大鼠急性期出现Ⅳ级以上的癫痫发作且经过1 w恢复后持续监测大鼠行为学表现。出现静息期癫痫发作的大鼠进行脑电图监测，若出现痫样放电则为慢性癫痫大鼠模型构建成功。对照组于相同时刻注射等量生理盐水。

1.4低频磁刺激(rTMS)治疗 将大鼠的头部固定于MagPro R30型磁刺激器(频率：0.5 Hz，40%MT)进行接收治疗，其余部位固定于非磁场区。每串100次，每日5串，间隔30 s，治疗持续14 d。假刺激组给予频率、次数及声音相似的刺激，无能量输出。

1.5观察指标

1.5.1大鼠癫痫发作情况 以模型构建成功为0 d，观察持续14 d，比较各组大鼠观察期间的癫痫发作次数及发作级别(取最高值)。发作级别评价参照Racine〔8〕的评价标准。

1.5.2大鼠CA3区PGP、MRP1及MVP水平检测 于观察结束后处死大鼠，检测CA3区PGP、MRP1及MVP水平，采用免疫组化法，操作严格按照说明书进行。采用Image Pro Plus6.0图像软件对目标蛋白的表达水平进行半定量分析，记录大鼠的平均光密度(IOD)。于治疗1、7、14 d分别处死5只小鼠检查目标蛋白表达量。

1.6统计学处理 采用SPSS21.0软件，计量资料比较采用t检验或单因素方差分析，等级资料采用秩和检验、计数资料行χ2检验。

2 结 果

2.1各组癫痫大鼠发作情况比较 模型组及假刺激组癫痫发作频率差异无统计学意义(P>0.05)，治疗组癫痫发作频率低于模型组及假刺激组(P<0.05)。各组大鼠癫痫发作频率及级别的差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠发作情况比较(n,n=15)

与模型组相比：1)P<0.05；与假刺激组相比：2)P<0.05

2.2各组CA3区PGP、MRP1及MVP表达水平比较 与对照组相比，模型组及假刺激组的PGP、MRP1及MVP表达水平显著升高(P<0.05)，但模型组与假刺激组间差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组PGP、MRP1及MVP表达水平显著低于模型组及假刺激组，较对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2，图1～图3。

表2 各组CA3区PGP、MRP1及MVP表达水平比较

与模型组相比：1)P<0.05；与假刺激组相比：2)P<0.05；与对照组相比：3)P<0.05

图2 各组MRP1免疫组化染色结果(×400)

图3 各组MVP免疫组化染色结果(×400)

2.3治疗组不同时点PGP、MRP1及MVP表达水平 与治疗1 d相比，治疗7 d的PGP无明显变化(P>0.05)，治疗7 d的MRP1及MVP表达水平显著降低(P<0.05)，治疗14 d的PGP、MRP1及MVP表达水平显著降低(P<0.05)。见图4。

图4 治疗组不同时刻PGP、MRP1、MVP表达水平

3 讨 论

目前，癫痫临床治疗仍以药物为主，尽管药物研究已经取得明显的进展，但仍有部分患者的疗效不佳，与患者的耐药性有关。癫痫患者耐药性与MDRP的表达具有密切的相关性，其中PGP、MRP1及MVP均与抗癫痫药(AEDs)的耐药现象相关。PGP及MRP1作为重要的药物转运蛋白，能够将AEDs泵出细胞，MVP通过胞吐及细胞核膜封锁复合体的产生阻止AEDs进入细胞〔9〕。

既往研究发现，癫痫患者存在MDRP高表达现象。Liu等〔10〕及Sisodiya等〔11，12〕研究发现手术切除的患者病灶中PGP、MRP1及MVP表达水平显著升高。Chen等〔13〕对杏仁核点燃构建的癫痫大鼠的大脑皮层及海马组织中的MRP表达水平进行检测，PCR及Western印迹显示MRP mRNA及蛋白表达水平均明显升高。本研究结果说明慢性癫痫大鼠脑组织中存在耐药蛋白高表达，导致耐药性的产生。

目前，对耐药蛋白表达的干预在癫痫治疗中的应用价值逐渐引起临床重视。Zhang等〔14〕研究发现维拉帕米能够通过阻断PGP相关的转运通道增强抗癫痫药物的作用。Mairinger等〔15〕发现PGP及MRP1能够阻止N-去甲基衍生物进入血脑屏障，降低抗癫痫药物的亲和力，故其在临床上的应用存在一定的争议。

李倩等〔16〕研究发现，经过rTMS治疗，大鼠丘脑内PGP的表达水平显著升高，与本次研究结果一致。本次研究发现，rTMS具有明显的后效应，这点对其用于癫痫的治疗非常重要。本研究说明低频rTMS能够通过降低MDRP的表达水平减轻癫痫症状，但低频rTMS影响MDRP表达水平的具体机制仍有待进一步研究。