小鼠骨髓源CD103+DC分离培养及LPS对其形态与功能特征的影响

侯艳华，张 凯，王 磊，孙 静，王旭荣，张 康，王学智，李建喜，张景艳

(中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所，甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃 兰州 730050)

树突状细胞(dendritic cells，DCs)是目前所知的功能最强的专职抗原提呈细胞，能够高效地摄取、加工处理和提呈抗原，在通过天然免疫与获得性免疫调节而维持机体稳态方面起着重要作用。未成熟的DC具有较强的迁移能力，可以作为检测器监测感染；成熟的DC可以刺激幼稚T细胞和B细胞的分化[1]。自加拿大学者Steinman和Cohn于1973年发现树突状细胞以来，它的生物学活性作用一直是人们研究的热点[2]。目前研究中用到的DC主要靠自主分离培养为主，故稳定的分离培养方法显得尤其重要。CD103+DC是髓样树突状细胞(myeloid dendritic cells，MDCs)的一员[3]，能够表达整合素分子αEβ7的α链CD103蛋白，广泛分布于淋巴组织(脾脏、淋巴结)和非淋巴组织(肠道、肺、肝脏、肾脏、皮肤等)中，影响调节性T细胞(regulatory cells，Tregs)和效应T细胞的平衡，从而调节适应性免疫应答[4-6]。Tregs是T淋巴细胞的一个特殊亚群，其主要功能是抑制免疫应答，包括免疫耐受、抑制自身免疫病、肿瘤抑制等。研究发现，肠道CD103+DC可以在视黄酸(RA)和转化生长因子(TGF-β)的作用下诱导CD4+Foxp3+Treg的产生，同时还可以指导T细胞表面归巢分子CCR9和α4β7的表达，从而启动免疫耐受[7-9]；体外培养发现，加入TGF-β后，CD103+DCs诱导的Foxp3+Tregs 水平显著增高，加入抗TGF-β单克隆抗体，则CD103+DCs诱导的Foxp3+Tregs水平显著降低[10-11]。当机体处于病理状态时，CD103+DC能够伸长树突，捕获抗原并将抗原递呈给T细胞，从而活化T细胞。肠上皮会发生炎性浸润，肠腔捕获抗原，携带抗原的CD103+DC在CCR7介导下进入肠系膜淋巴结，在TLR配体的刺激下CD103+DC能分泌IL-6，进而诱导Th17的分化，参与固有免疫反应和某些炎性反应[12-14]；King等[15]将皮肤淋巴结CD103+DCs与初始T细胞共培养发现，CD103+DCs能诱导Th0细胞向Th1细胞分化；另外还有一些研究表明，CD103+DC是诱导Th0细胞向Th2细胞分化的关键物质[16]。由此可见，CD103+DC在维持机体免疫与免疫耐受平衡中起着重要作用，建立一种稳定的CD103+DC体外培养方法，对研究CD103+DC起源、生物学特征、治疗应用具有重要意义。本研究旨在建立小鼠骨髓源CD103+DC的培养和鉴定方法，并阐述LPS对其形态与功能特征的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级4～8周龄的C57BL/6雌性小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXX(京)2016-0011]。

1.2 主要试剂

Recombinant Mouse GM-CSF购自R&D Systems公司；Mouse FLT3L Recom-binant Protein Carrier-Free、Anti-Mouse CD103-PE、Anti-Mouse MHC-Ⅱ-FITC、Anti-Mouse CD83-FITC购自eBioscience公司；RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(DPBS)购自Gibco公司；红细胞裂解液、MTT试剂盒、4%多聚甲醛、25%戊二醛、荧光淬灭剂均购自索莱宝公司；青-链霉素(双抗)、VOA-FITC、LPS、多聚L赖氨酸包被的盖玻片购自Sigma公司；Anti-Mouse CD103免疫磁珠购自MiltenyiBiotec公司；尼龙毛柱购自Polysciences公司；Anti-Mouse CD103、Antibody To Rabbit IgG(H+L)购自KPL公司；细胞培养板和细胞筛购自Corning公司。

1.3 主要仪器及设备

低温冰箱(MDF-382，SYNYO，日本)；CO2细胞培养箱(1209，Thermo Scientific，美国)；倒置显微镜(22EB，LEICA，德国)；酶标仪(SpectraMax®M2e，Molecular，美国)；生物安全柜(HF Safe-1500，力康生物医疗科技有限公司，中国)；离心机(3K15，Sigma，德国)；免疫荧光显微镜(IX71，OLYMPUS，日本)；扫描电镜(JEOL，JSM-6510，日本)；流式细胞仪(CYTOMICS FC 500，Beckman，美国)。

1.4 完全培养基配制

取100 μL 200 μg·mL-1的FLT3L、100 μL 10 μg·mL-1的GM-CSF、5 mL的FBS和1 mL双抗溶于94 mL的RPMI-1640完全培养基，使FLT3L和GM-CSF的工作浓度分别为200和10 ng·mL-1。

1.5 小鼠骨髓源细胞的培养

取6～8周龄的C57BL/6小鼠，脱颈处死，置于75%乙醇中浸泡30 min；用DPBS冲洗小鼠的胫骨、腓骨腔以获得骨髓源细胞，300g离心5 min，弃上清；以比例为1∶3的DPBS和红细胞裂解液重悬细胞，静置2 min，300g离心5 min，弃上清；再加入DPBS重悬细胞，用细胞筛过滤，滤液300g离心5 min，弃上清；加入完全培养基悬浮细胞，使细胞浓度约为1.5×107mL-1，将其移至6孔细胞板中培养；分别在培养第3天和第5天时，每孔加2 mL的完全培养基继续培养；于第9天收集细胞，300g离心5 min，加入完全培养基重悬，继续培养至第15天，收获细胞。

1.6 CD103+DC的鉴定

1.6.1 扫描电镜观察CD103+DC形态

培养至第15天的骨髓源细胞，加LPS(工作浓度100 ng·mL-1)处理24 h，收集细胞至15 mL离心管，300g离心 5 min；将细胞用完全培养基重悬，转入放置多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的48孔细胞培养板中，培养24 h后可见部分细胞贴壁，弃去细胞悬液；用DPBS清洗3次，每次5 min；2.5%的戊二醛4 ℃固定1 h；弃去戊二醛，DPBS清洗3次；依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的乙醇逐级脱水，自然干燥；取出盖玻片，喷晶观察。

1.6.2 CD103+DC的荧光显微镜观察

培养至第15天的骨髓源细胞，加LPS(工作浓度为100 ng·mL-1)处理24 h；收集细胞至15 mL离心管，300g离心 5 min，将细胞用完全培养基重悬，转入放置多聚赖氨酸包被无菌盖玻片的6孔细胞培养板中，培养24 h后可见部分细胞贴壁，弃去细胞悬液；用DPBS清洗3次，每次5 min；4%多聚甲醛室温下固定20 min，DPBS清洗3次；0.2% Triton-100通透15 min，DPBS清洗3次；5%BSA于4 ℃下包被30 min，DPBS清洗3次；按1∶100比例加入一抗(Anti-Mouse CD103)，37 ℃温箱孵育2 h，DPBS清洗3次；按1∶100比例加入二抗(Antibody To Rabbit IgG(H+L))，37 ℃温箱避光孵育1 h，DPBS清洗3次；加入10 μL DAPI，室温下孵育10 min，DPBS清洗3次；取出盖玻片，用荧光淬灭剂封片；荧光显微镜观察。

1.6.3 CD103+DC流式细胞术鉴定

收集培养至16 d的骨髓源细胞，300g离心5 min，弃上清，经过Anti-CD103磁珠分选得到纯化的CD103+DC，具体方法参照美天旎Anti-CD103免疫磁珠阳性分选试剂盒说明书。

收集纯化的骨髓源细胞，用DPBS将细胞浓度调整至1×106mL-1；分别取1 mL细胞悬液转入1.5 mL的EP管中，分别加入5 μL的Anti-Mouse CD103-PE与其同型对照仓鼠IgG-PE，37 ℃避光孵育30 min；300g离心5 min，弃上清，DPBS清洗2次；分别加入500 μL DPBS重悬细胞，过膜并转移至专用检测管，流式细胞仪检测。

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1.7 CD103+DC细胞功能鉴定

1.7.1 流式细胞术检测细胞的吞噬功能

培养至第15天的骨髓源细胞，设LPS和RPMI-1640组，前者LPS(工作浓度为100 ng·mL-1)处理24 h。分别收集细胞至15 mL离心管，300g离心 5 min，弃上清，DPBS清洗2次，再用DPBS将细胞浓度调整至1×106mL-1；分别取1 mL细胞悬液转入1.5 mL的EP管中，各加入10 μL的VOA-FITC，37 ℃避光孵育4 h为实验组，4 ℃避光孵育4 h为同型对照组；300g离心5 min，弃上清，DPBS清洗2次；加入500 μL DPBS重悬细胞，过膜并转移至专用检测管中，流式细胞仪检测。

1.7.2 流式细胞术检测细胞的抗原提呈功能相关分子

培养至第15天的骨髓源细胞，设LPS和RPMI-1640组，前者LPS(工作浓度为100 ng·mL-1)处理24 h。分别收集细胞至15 mL离心管，300g离心 5 min，弃上清，DPBS清洗2次；用DPBS将细胞浓度调整至1×106mL-1；分别取1 mL细胞悬液转入不同的1.5 mL EP管中，分别加入小鼠MHC-Ⅱ-PE单抗、小鼠CD83-FITC及对应的同型对照；37 ℃避光孵育30 min，300g离心5 min，弃上清，DPBS清洗2次；然后加入500 μL DPBS重悬细胞，过膜并转移至专用检测管中，流式细胞仪检测。

1.7.3 混合T淋巴细胞体外增殖检测

采用MTT法。取6～8周龄的C57BL/6小鼠，脱颈处死，75%乙醇浸泡30 min，无菌条件下分离脾脏，制备组织匀浆，300g离心5 min，弃上清；加入3倍体积的红细胞裂解液作用2 min，300g离心 5 min，弃上清；加入DPBS悬浮细胞，用细胞筛过滤，滤液300g离心 5 min，弃上清；加PMI-1640完全培养基悬浮细胞，注入尼龙毛柱，置于CO2培养箱中37 ℃培养1 h，得纯化T淋巴细胞；调整T淋巴细胞浓度为1×106mL-1，然后取100 μL加入96孔细胞培养板中。共分为6组，每组设5个重复。

培养至第15天的骨髓源细胞，加LPS(工作浓度100 ng·mL-1)处理24 h；收集细胞至15 mL离心管，300g离心 5 min，弃上清；加PMI-1640完全培养基，调整CD103+DC细胞浓度至1 ×106mL-1；分别以100∶0、100∶1、50∶1、25∶1、12.5∶1、6.25∶1的比例混合T淋巴细胞和CD103+DC细胞，其中100∶0为空白对照；用PMI-1640完全培养基补充每孔体积至200 μL，置于CO2培养箱中37 ℃培养4 d；取出后每孔加入20 μL的MTT(浓度为5 mg·mL-1)，继续培养4 h；每孔再加入150 μL的DMSO，振荡10 min；酶标仪上570 nm处检测D值，计算细胞刺激指数(SI)。细胞刺激指数(SI)=实验孔D值/对照孔D值。

1.8 统计学分析

2 结果与分析

2.1 骨髓源树突状细胞形态变化

将分离得到的骨髓单个核细胞，用细胞因子GM-CSF和FLT3L联合处理，CO2培养箱中37 ℃培养第1天，细胞呈圆形，表面光滑，有少量细胞聚集(图1-A)；培养至第3天，细胞集落开始形成(图1-B)。随着培养时间的延长，细胞集落增多、增大，细胞形态有明显变化，呈圆形、椭圆形或不规则性形，细胞表面开始出现树突，树突随培养时间的延长而增多、增长；培养至第13天，集落最多、最大(图1-D)，第14天后细胞开始悬浮，呈单个生长，且细胞树突增多(图1-E)。图1-F为培养至第15天时，用100 ng·mL-1的LPS处理24 h的细胞形态，细胞体积变大，细胞树突变多、变长。扫描电镜下细胞轮廓清晰，形态大小不一，表面粗糙不平，结构保持完整，有明显树突状结构，微绒毛和突起清晰可见，RPMI-1640组BMCs树突较少、较短；LPS处理24 h后，细胞树突明显变多、变长(图2)。

2.2 CD103+DC表面特征分子CD103表达情况

LPS处理的骨髓源细胞，经CD103单抗(FITC标记的兔IgG)和二抗DAPI染色处理后，荧光显微镜下细胞膜呈绿色(图3-D)、细胞核呈蓝色(图3-E)，细胞膜位置与细胞核染色位置基本重合(图3-F)，部分细胞有集落现象，有明显的树突状结构。RPMI-1640组的骨髓源细胞膜和细胞核在荧光显微镜下，呈现与LPS处理组相同的颜色变化，但细胞多呈散在性分布，树突状结构不明显(图3-A、B、C)。

分别用流式细胞术分析了未经CD103免疫磁珠纯化和经CD103免疫磁珠纯化的骨髓源细胞表面分子，结果如图4所示。未经免疫磁珠纯化的CD103+DC比率为(90.27±2.03)%，而经免疫磁珠纯化的CD103+DC比率为(93.35±1.74)%，二者间无明显差异(P>0.05)。该结果提示，本实验条件下可以从C57BL/6小鼠的骨髓细胞中诱导获得阳性率较高的CD103+DC。

A， 第1天；B， 第3天；C， 第9天；D， 第13天；E， 第16天；F， LPS刺激24 h。1、2和3为细胞集落；4、5为DC. 400×。A， 1st day；B， 3rd day；C， 9th day；D， 11th day；E， 13th day；F， The cell treated by LPS for 24 h; 1， 2 and 3 are cell colonies; 4 and 5 are DCs. The magnification is 400 times.图1 培养过程中BMCs的形态变化Fig.1 The morphological change of BMCs

A， RPMI-1640组；B， LPS组。2 500×。A， The group of RPMI-1640；B， BMCs treated by LPS. The magnification is 2 500 times.图2 扫描电镜下BMCs形态Fig.2 BMCs shape under the scanning electronmicroscope

2.3 CD103+DC吞噬能力与抗原提呈相关分子表达的评价

2.3.1 LPS对CD103+DC细胞吞噬能力的影响

采用流式细胞术对不同处理组CD103+DC吞噬能力进行了分析。结果如图5和表1所示，RPMI-1640组中VOA+的细胞占总细胞数的比例为25.70%，而经LPS处理组中VOA+的细胞占总细胞数的比例仅为10.33%，差异极显著(P<0.01)。由此可以看出，实验中得到的小鼠骨髓源CD103+DC具有一定的抗原吞噬功能；同时100 ng·mL-1LPS处理24 h后，VOA+CD103+DC的数量明显降低，表明该细胞经LPS诱导后抗原吞噬能力下降趋势。

A，RPMI-1640组，细胞膜CD103-FITC荧光标记；B，RPMI-1640组，BMCs细胞核DAPI染色；C，A图和B图的合并图；D，LPS处理组，BMCs细胞膜CD103-FITC荧光标记；E，LPS处理组，BMCs细胞核DAPI染色；F，D图和E图的合并图。200×。A， BMCs membrane labeled with CD103-FITC in the group of RPMI-1640；B， BMCs nucleus labeled with DAPI in the group of RPMI-1640；C， Merged figure of A and B；D， MBCs membrane labeled with green fluorescence in the group of LPS；E， BMCs nucleus labeled with DAPI in the group of LPS；F， Merged figure of D and E. Magnification， 200×.图3 BMCs表面分子CD103免疫荧光鉴定Fig.3 Immunofluorescence assay of the surface molecules CD103 on BMCs

A，同型对照；B，未经免疫磁珠纯化的CD103+DC阳性率为90.27%； C，经免疫磁珠纯化的CD103+DC阳性率为93.35%。A， Isotype control; B， Positive ratio of CD103+DC untreated with immunomagnetic beads was 90.27%; C， Positive ratio of CD103+DC treated with immunomagnetic beads was 93.35%.图4 BMCs表面分子CD103流式细胞术鉴定Fig.4 FACS assay of the surface molecules CD103 on BMCs

A，同型对照； B，RPMI-1640组 CD103+DC的吞噬率为25.79%； C，LPS处理组CD103+DC的吞噬率为10.33%。A， Isotype control; B， The phagocytosis rate of CD103+DC in the group of RPMI-1640 is 25.79%； C， The phagocytosis rate of CD103+DC was 10.33% in the group of LPS.图5 CD103+DC的细胞吞噬能力流式细胞术检测Fig.5 FAC assay of the phagocytosis of CD103+DC

2.3.2 LPS对CD103+DC表面功能分子表达的影响

采用流式细胞术对不同处理组CD103+DC的抗原提呈相关分子MHC-Ⅱ、CD83的表达进行了分析。结果如图6和表1所示，RPMI-1640组MHC-Ⅱ+CD103+DC、CD83+CD103+DC的细胞比例分别为41.31%、13.79%；而经LPS处理组中MHC-Ⅱ+CD103+DC、CD83+CD103+DC的细胞比例分别为68.10%、24.71%，即LPS处理后CD103+DC的MHC-Ⅱ、CD83表达率显著增高(P<0.01)。由此可以看出，实验中得到的小鼠骨髓源CD103+DC表面有MHC-Ⅱ、CD83表达；同时100 ng·mL-1LPS处理24 h后，MHC-Ⅱ+CD103+DC、CD83+CD103+DC的数量明显增加，表明一定量LPS可以促进小鼠CD103+DC表面分子MHC-Ⅱ、CD83的表达。

2.4 CD103+DC刺激T细胞增殖的能力

成熟的CD103+DC能够刺激T细胞活化、增殖，一般用刺激指数计算。本实验将经LPS组和RPMI-1640组CD103+DC分别按1∶100、1∶50、1∶25、1∶12.5、1∶6.25的比例与T细胞混合培养4 d后，刺激指数如表2所示。当CD103+DC与T细胞比例为1∶100时，LPS组和RPMI-1640组刺激指数差异不显著(P>0.05)；当CD103+DC与T细胞比例为1∶50时，LPS组和RPMI-1640组刺激指数差异显著(P<0.01)；而当CD103+DC与T*表示LPS组与RPMI-1640组相比差异显著(P<0.05)；** 表示LPS组与RPMI-1640组相比差异极显著(P<0.01)。下同。

A，IgG-PE；B，RPMI-1640组， 41.31%的CD103+DC表达MHC-Ⅱ；C，LPS组，68.10%的CD103+DC表达MHC-Ⅱ；D，CD83-FITC同型对照；E，RPMI-1640组，13.79%的CD103+DC表达CD83；F，LPS组，24.71%的CD103+DC表达CD83。A， IgG-PE；B， 41.31% CD103+DC expressed MHC-II in the group of RPMI-1640; C， 68.10% CD103+DC expressed MHC-II in the group of LPS; D， IgG-FITC; E， 13.79% CD103+DC expressed CD83 in the group of RPMI-1640；F， 24.71% CD103+DC expressed CD83 in the group of LPS.图6 CD103+DC的抗原提呈相关分子流式细胞术检测Fig.6 FAC assay of the molecules related antigen presentation of CD103+DC

* indicates the significant difference between LPS group and RPMI-1640 group (P<0.05)； ** indicates the extremely significant difference between LPS group and RPMI-1640 group (P<0.01). The same as below.

细胞比例为1∶25、1∶12.5、1∶6.25时，LPS组和RPMI-1640组刺激指数差异均极显著(P<0.01)。

结果表明，本实验条件下分离获得的CD103+DC具有刺激T细胞增殖的能力，LPS处理有增强树突状细胞刺激T细胞增殖的作用。

3 讨论

树突状细胞是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，其在体内广泛分布，尤其是与外界接触的组织，如皮下、黏膜组织。DC具有长长的树突，能够捕获抗原并将其递呈给T细胞，启动免疫应答。DC具有多种亚群，可根据其对转录因子的依赖性、表型、定位和功能等的差异进行区分[17]。其中，CD103+DC被认为是一种与黏膜免疫密切相关的树突状细胞，它可以通过促进炎性通路的发生和维持免疫耐受来调节肠道免疫反应。CD103+DC和其他树突状细胞一样，可以由骨髓源前体细胞中分化而来，这为体外分离和培养CD103+DC提供了一种可能。研究表明，用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)处理骨髓源单核细胞，可诱导获得单核源树突状细胞(moDC)；用FMS样丝氨酸激酶3配体(FIT3L)处理骨髓源常规样树突状前体细胞(pre-cDC)，可以获得浆细胞样树突状细胞(pDC)、CD11b+cDC和CD24+cDC；如果用GM-CSF和FIT3L共同处理骨髓源pre-cDC，可以获得CD103+cDC[18-19]。虽然有从骨髓中诱导分化和培养CD103+DC的成功案例，但要在体外获得数量足够多的高纯度CD103+DC，难度较大。

本实验参考文献[20-22]，以C57BL/6雌性小鼠的胫骨和腓骨骨髓为分离源，获得了骨髓细胞；用含有10%FBS、10 ng·mL-1GM-CSF和200 ng·mL-1FLT3L的RPMI-1640完全培养基，培养分离的骨髓细胞。培养到第3天，显微镜下可观察到零星的小集落开始形成；在第3天和第5天分别补充1/2体积的完全培养基并继续培养，至第9天可观察到较大的细胞集落，此时离心收集悬浮细胞用完全培养基继续培养至第15天，可观察到分散生长、轮廓清晰、有树突样结构的单个悬浮细胞；在第15天加入LPS(工作浓度100 ng·mL-1)作用24 h后，具有树突状结构的细胞数量增多，且细胞的树突明显增多、变长(图1、2)。表明C57BL/6雌性小鼠的胫骨和腓骨骨髓中可分离培养出树突状细胞，培养至第3天和5天时分别补充一次培养基更有利于树突状细胞的生长，第15天用一定量的LPS处理24 h，可获得树突结构更明显的细胞。

CD103+DC表面表达的CD103分子是鉴定该类细胞的标志。本实验利用FITC标记的兔抗鼠CD103单抗和DAPI对小鼠骨髓源树突状细胞进行双染处理，结果可见细胞膜在荧光显微镜下呈绿色、细胞核呈蓝色，表明分离于C57BL/6雌性小鼠的胫骨和腓骨骨髓的树突状细胞中具有CD103+DC，LPS具有诱导该类细胞数量增加的可能(图3)。免疫磁珠法是分选阳性细胞常用的技术之一[23]，本实验用该方法对经LPS诱导处理的CD103+DC进行了纯化，流式细胞术检测结果表明，免疫磁珠纯化前后的树突状细胞中CD103+DC阳性率均达90%以上(图4)，说明本实验条件下可分离培养出阳性率较高的CD103+DC，免疫磁珠分选步骤可以省略。

吞噬功能是树突状细胞抗原提呈生理机能得以启动的重要机制之一，未成熟的树突状细胞抗原吞噬作用强，抗原提呈功能弱；一旦树突状细胞成熟后，其吞噬作用减弱，抗原提呈作用增强，并高表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子、共刺激分子CD80与CD86、细胞间黏附分子CD40和ICAM-1(CD54)等[24-26]。研究发现，CD83是表达成熟树突状细胞和活化T、B淋巴细胞的重要功能分子[27-28]。本研究中，经LPS处理后CD103+DC抗原吞噬能力减弱，说明LPS刺激有利于CD103+DC的成熟；经LPS处理后CD103+DC的MHCⅡ和CD83的表达量明显增加，说明LPS刺激有利于增强CD103+DC抗原提呈能力。成熟的CD103+DC主要是通过其刺激T细胞活化和增殖的途径而实现其重要的免疫学功能[29-30]。本实验将LPS处理和未处理的CD103+DC，分别按不同比例与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养4 d，MTT法检测结果显示，LPS处理后CD103+DC刺激T细胞增殖的能力有显著提升(表2)。这说明用GM-CSF、FLT3L联合处理获得的小鼠骨髓源CD103+DC，再用LPS刺激后可促进CD103+DC的成熟。