浙江省新昌县茶叶炭疽病病原鉴定及其药剂敏感性测定

谢昀烨，曾思锦，袁 月，王连平，方 丽，王汉荣，*

(1.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021；2.长江大学 园艺园林学院，湖北 荆州 434000；3.新昌县清河茶叶专业合作社，浙江 新昌 312500)

茶叶(Camelliasinensis)作为我国的一种传统保健饮品，广为人们所喜爱，也是重要的具有中国特色的出口商品之一。而茶叶炭疽病是茶树叶部的主要病害之一，在浙江、福建、贵州等主要产茶省份均有发生[1-3]。该病害主要侵染成叶，在嫩叶和老叶上也有发生，发病后叶部出现病斑，影响光合作用，造成早期落叶，植株生长势变弱，影响茶的产量与质量[4]。据报道，我国能侵染茶树引起炭疽病的病原菌有9种，分别是山茶刺盘孢菌(Colletotrichumcamelliae)[5-7]、 雕刻刺盘孢菌(C.carveri)[8]、壳皮炭疽菌(C.crassipes)、果生刺盘孢菌(C.fructicola)[8，10]、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)[5，9-10]、河南刺盘孢菌(C.henanense)[8，10-11]、马尤斯刺盘孢菌(C.majus)[9-10]、暹罗刺盘孢菌(C.siamense)[6，11]和江西刺盘孢菌(C.jiangxiense)[10-11]。

2016年7月，浙江省新昌县东茗村茶叶基地大面积发生茶叶炭疽病，田间湿度大时发病面积高达70%左右，严重影响了茶叶的产量及质量。茶农由于缺乏对该病的了解，盲目用药，导致农药残留超标等茶叶质量安全隐患，严重影响了浙江省茶农增收。为此，我们对该基地的茶叶炭疽病进行了调查和病原菌分离鉴定，实验室内筛选出对该病原菌有一定抑制作用的杀菌剂，以期为浙江省新昌县茶叶炭疽病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集

从浙江省新昌县茶叶基地采集具有典型炭疽病症状的样本，带回实验室进行分离鉴定。

1.2 病原菌分离及纯化

采用组织分离法对病原菌进行分离，将叶片浸泡在70%乙醇中1 min进行表面消毒，无菌水浸洗3次后晾干，在茶叶病斑的病健交界处用灭过菌的剪刀剪取5 mm2大小的组织块，用灭菌的镊子夹至PDA平板，置于25 ℃恒温培养箱中培养。待菌丝长出之后挑取生长外缘的菌丝块转至新的PDA平板中进行菌株纯化，标记为CHY1、CHY2、CHY3、CHY4、CHY5和CHY6。

1.3 病原菌形态观察

经显微观察后6个菌株均为同一菌种，并选取代表性菌株CHY4作为供试菌株。将纯化好的CHY4菌株转至PDA平板中，25 ℃恒温培养7 d后，对病原的菌落形态、孢子形态大小及颜色进行观察描述并拍照。

1.4 病原菌致病性测定

采用伤口接种法对健康的茶树植株叶片进行接种试验。刮取培养2周的CHY4菌株的菌落表面孢子，用无菌水配置成107mL-1的孢子悬浮液喷在叶片上，置于光照培养箱中保湿培养5 d后观察记录叶片发病状况。

1.5 病原菌rDNA ITS序列的测定

采用CTAB法对菌株CHY4进行DNA提取，并针对其核糖体内转录区间(rDNA-ITS)片段进行PCR扩增，扩增引物为ITS1/ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTATTGATATGC-3′)。将PCR产物送至上海生物有限公司进行纯化并测序，并通过GenBank基因序列库内序列信息进行比对，获得基因序列号。

1.6 病原菌药剂敏感性测定

采用菌丝生长速率法[12]对病原菌进行15种杀菌剂的筛选，供试药剂有：250 g·L-1吡唑醚菌酯乳油(巴斯夫植物保护(江苏)有限公司)、65%代森锌可湿性粉剂(山东利邦农化有限公司)、45%咪鲜胺微乳剂(北京中农研制高科技有限公司)、250 g·L-1丙环唑乳油(青岛金尔农化研制开发有限公司)、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂(江苏龙灯化学有限公司)、325 g·L-1苯甲·嘧菌酯悬浮剂(瑞士先正达作物保护有限公司)、10%苯醚甲环唑水分散粒剂(山东荣邦化工有限公司)、430 g·L-1戊唑醇悬浮剂(青岛金尔农化研制开发有限公司)、38%唑醚·啶酰菌水分散粒剂(巴斯夫欧洲公司)、10%己唑醇悬浮剂(江西海阔利斯生物科技有限公司)、12.5%烯唑醇可湿性粉剂(江苏辉丰农化股份有限公司)、25 g·L-1咯菌腈悬浮种衣剂(先正达南通作物保护有限公司)、42.8%氟菌·肟菌酯悬浮剂(德国拜耳作物科学公司)、50%多菌灵可湿性粉剂(苏州遍净植保科技有限公司)、50%啶酰菌胺水分散粒剂(巴斯夫欧洲公司)。CHY4为供试菌株，将供试药剂配制成质量浓度分别为1×103、1×102、10、1、1×10-1、1×10-2mg·L-1的含毒平板。将活化好的菌株用打孔器打取直径为5 mm的菌饼，然后用无菌的镊子夹至含毒平板中央，菌丝面朝下，72 h后采用十字交叉法测量菌落直径。以加等量无菌水的PDA平板为对照，每个处理3次重复。根据药剂对病原菌的生长抑制率查得几率值，并建立毒力回归方程，计算出其有效中浓度(EC50)和抑菌率为90%所对应的浓度(EC90)，比较各杀菌剂对该病原菌的敏感性程度。

2 结果与分析

2.1 病害症状描述

2016年5—11月对浙江省新昌县东茗乡茶叶基地种植的品种为龙井43号的茶树进行观察，发现该病主要发生在叶部，多发在老叶上，嫩叶上发病率较少；8—11月为该病的高发期，发病面积高达70%左右，茶园内茶树下部叶片呈火烧状，发病严重时连成一片。茶园内发病而引起的落叶不及时清理可加重茶树的发病率。该病原菌多由叶尖或叶缘开始侵染，病斑形状不规则，初为水渍状暗绿色小点，后扩大变为红褐色，病斑大小不一，发病后期病斑转为灰白色，且可清晰观察到深褐色小粒点，即分生孢子盘(图1)。

2.2 病原菌分离及纯化

对采集得到的具有明显病害症状的病斑进行分离，所有样本均分离纯化得到相似菌株，抽取6个菌株并编号为CHY1-6，保存于浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所。

图1 新昌茶叶炭疽病田间病害症状Fig.1 Field symptoms of tea anthracnose in Xinchang

2.3 病原菌致病性测定

将配置好的分离物孢子悬浮液(107mL-1)接种在健康的茶树叶片上，5 d后发现接种的叶片出现水渍状小点，2周后沿叶尖或叶缘逐渐扩大，湿度大时病斑为棕褐色，病健交界处明显，与田间发病症状一致，重新分离后的分离物与接种病原菌一致(图2)。清水对照接种的叶片均未发病。

2.4 病原菌形态学特征

CHY4菌株在PDA培养基上菌落为灰绿色，菌丝呈放射状，菌丝茂盛，3 d后呈毛绒状。2周后可在菌落中央产生大量散生的橘红色分生孢子堆；分生孢子无色单孢，表面光滑、圆柱形、两端钝圆，(8.7～17.8)μm×(3.5～6.1)μm；分生孢子盘珊状，长90～180 μm，着生于茶叶表皮，未见刚毛(图3)。

2.5 病原菌rDNA ITS序列的测定与比较

CHY4菌株的ITS序列PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测长度约为500 bp(图4)，将扩增的PCR产物送至上海生工生物公司进行序列测序。测序所得550 bp序列(GenBank登录号为MF918484)结果与GenBank基因库内信息进行Blast比对，与Colletotrichumgloeosporioides(HM013821)相似度达100%，进一步确定引起的茶叶炭疽病的致病菌为胶孢炭疽菌。

2.6 病原菌药剂敏感性测定

15种药剂对茶叶炭疽病病原菌的敏感性结果见表1。代森锌(蓝钻)、咪鲜胺(中研)、丙环唑(金阿泰)和甲基硫菌灵(日曹)对茶叶炭疽病菌丝生长的抑制效果很好，其EC50值均小于1 mg·L-1；苯甲·嘧菌酯(阿米妙收)、苯醚甲环唑(凯高)、戊唑醇(青岛金尔)、唑醚·啶酰菌(凯津)和己唑醇(治杰)对茶叶炭疽病菌丝生长的抑制效果较好，其EC50值均大于1 mg·L-1且小于10 mg·L-1；烯唑醇(禾果利)、咯菌腈(适乐时)和氟菌·肟菌脂(露娜森)的效果相对较差，EC50值分别为13.910 3、163.464 5和202.907 8 mg·L-1；多菌灵(吴农)和啶酰菌胺(凯泽)对茶叶炭疽病菌丝生长基本没效果，EC50值分别为1 821.687 1和994 444.789 3 mg·L-1。

A， 对照；B和C，接种叶片。A， CK; B & C， Inoculated leaves.图2 茶叶炭疽病叶部接种发病症状(CHY4)Fig.2 Symptom on Camellia sinensis leaves after inoculation (CHY4)

A，菌落形态；B，分生孢子盘；C，分生孢子。A， Colony on PDA; B， Acervulus on Camellia sinensis; C， Conidia.图3 新昌茶叶炭疽病病原菌菌落、分生孢子盘、分生孢子形态及显微结构特征Fig.3 Morphological characteristics of the pathogen Colletotrichum gloeosporioides

A，10 000 bp 基因标尺；B，目标病原菌电泳图(泳道1为基因标尺；泳道2为菌株CHY4 ITS扩增条带)。A， 10 000 bp DNA marker; B， Agarose gel electrophoresis picture(Lane 1， DNA marker; Lane 2， Gene band of CHY4 strain).图4 炭疽病病原菌CHY4 菌株ITS序列扩增电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of ITS sequence of the pathogen Colletotrichum gloeosporioides (CHY4)

3 讨论

从浙江省新昌县茶叶基地发病的茶叶叶片中分离得到致病性菌株。根据该病原菌的形态结构特征、培养性状、分子鉴定结果表明：分离得到的病原菌为胶孢炭疽菌。目前，已有9种炭疽菌属真菌可引起茶树的炭疽病，引起浙江省茶树炭疽的有C.camelliae、C.fructicola和C.karstii，而C.gloeosporioides仅在福建、安徽和江西的茶树上发现。C.gloeosporioides的寄主非常广，可侵染树木和花卉等植物，而胶孢炭疽菌引起的油茶炭疽病也是油茶的主要病害[13-14]。本研究中新昌县龙井43号为茶园的主要品种，2015年凌光汉等[15]对该地区的茶树炭疽病的发生与防治进行了报道，但是并没有确定病原菌种类。

表1 15种杀菌剂对茶叶炭疽病的毒力回归方程及EC50、EC90值

本实验测定了15种杀菌剂对新昌茶树炭疽病病原菌的敏感性，其中250 g·L-1吡唑醚菌酯、65%代森锌、45%咪鲜胺、250 g·L-1丙环唑和70%甲基硫菌灵对茶叶炭疽病菌丝生长的抑制效果非常好，EC50值均在1 mg·L-1以下；刘伟[16]在对湖北省油茶炭疽病的药剂防治试验结果中发现，10%苯醚甲环唑、25%丙环唑乳油和12.5%戊唑醇可湿性粉剂对胶孢炭疽菌都有良好的防治效果，这与本实验中的结果相一致，虽然寄主上有差别，但是对胶孢炭疽菌的抑制效果相差不大；曹志华等[17]的实验结果同样认为，10%苯醚甲环唑对胶孢炭疽菌的效果较好，但是25%的咪鲜胺和80%多菌灵的效果并不明显，而本实验中选用的45%咪鲜胺对胶孢炭疽菌的效果较好，说明高浓度的咪鲜胺对该病原菌的效果较好，但是增加药剂的浓度有可能会增加茶叶的农药残留量。然而室内药剂筛选试验具有可控性，而田间病害的发生环境难以控制，因此室内药剂筛选的结果还需要田间药效试验的验证。2015年唐美君等[18]对茶树炭疽病进行了田间药效试验，结果表明，250 g·L-1吡唑醚菌酯对炭疽病的田间防效可达到89.2%～98.2%，说明吡唑醚菌酯不仅在实验室内对病原菌生长有抑制作用，在田间对病害的发生也有较好的控制作用。因此，我们建议使用250 g·L-1吡唑醚菌酯对田间茶炭疽病进行防控。