四川部分地区断奶前犊牛贾第虫感染调查和基因分型研究

但佳明，欧红萍，严光文，田一男，魏 斌，涂 蕊，肖启程，唐 丽，杨亭玉，彭广能，王永刚，钟志军*

(1.四川农业大学 动物医学院 动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130； 2.成都农业科技职业学院，四川 成都 611130； 3.西昌学院 动物科技学院，四川 西昌 615000； 4.北川羌族自治县曲山镇畜牧兽医站，四川 绵阳 622750)

贾第虫(Giardiaduodenalis)又名蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)、肠贾第虫(Giardiaintestinalis)，寄生于动物肠道内，主要通过饮水或食物传播[1]，可感染人及某些哺乳动物，引起患病动物出现腹泻、呕吐等症状[2]，是一种重要的人兽共患寄生虫[3]。因此，对贾第虫进行流行情况调查与基因型研究越来越受到科学家的重视。贾第虫是一个复杂的集合体，目前已鉴定8个(A～H)不同的集聚体，各集聚体之间存在宿主特异性[4-5]。其中，集聚体A和B主要感染人和多种哺乳动物，集聚体C和D主要在犬科动物中发现，集聚体E主要感染偶蹄动物，集聚体F主要感染猫科动物，集聚体G和H分别在啮齿类和海洋哺乳动物中被发现[6]。引起人类贾第虫病的集聚体主要为集聚体A和B，近年来有研究[7-9]表明，聚集体C、D、E、F偶尔会在人中发现，并且包括人在内的多种动物体内均发现了集聚体E感染[10]，提示上述集聚体也存在一定的人兽共患性。研究表明，奶牛以集聚体A、B、E为优势集聚体[11-12]，在我国东北、西北部分地区，奶牛以集聚体E为优势集聚体[13-14]，而在河南以集聚体A为优势集聚体[11]。奶牛作为经济动物，在人类生产生活中占有重要地位，贾第虫感染携带不仅对奶牛养殖造成经济损失，对人类健康也存在一定的威胁。其中，断奶前犊牛由于其贾第虫感染率较高[11-12，15]，且集中排泄包囊，在人兽共患风险方面越来越引起人们的注意[16]。本研究对四川部分地区断奶前犊牛贾第虫感染情况进行调查，经巢式PCR扩增贾第虫β-giaidin(bg)、tpi和gdh基因序列，对阳性样品贾第虫集聚体进行鉴定，为四川地区断奶前犊牛贾第虫流行情况以及流行集聚体种类研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

E.Z.N.A.®Stool DNA Kit(粪便DNA提取试剂盒)购自美国OMEGA Bio-Tek公司；2×Taq PCR Master Mix购自天根生化科技(北京)有限公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.2 样品采集

2016年6月至2017年3月在四川省10个地区11个奶牛场(成都、洪雅、阿坝、眉山、资阳、安岳、邛崃、青白江、德阳各1个奶牛场，绵阳2个奶牛场)采集1月龄内断奶前犊牛粪便共计278份，每份粪样约50 g，置于洁净的塑料采样袋中，做好相应标记、编号，于4 ℃下保存待检。

1.3 样本DNA提取

采用改良饱和蔗糖溶液漂浮法处理粪便，得到含粪便及卵囊的沉淀物，按E.Z.N.A.®Stool DNA Kit说明书步骤操作，提取的DNA 置-20 ℃环境保存。

1.4 PCR扩增

基于β-贾第素(β-giaidin)基因对所有样品进行检测，引物设计及扩增条件参照Sulaiman 等[17]报道。基于β-贾第素(β-giaidin)基因鉴定出的阳性样品，使用磷酸丙糖异构酶(tpi)、谷氨酸脱氢酶(gdh)位点进行基因亚型鉴定，引物设计及扩增条件参照Appelbee等[18]和Caccio等[19]的报道。反应体系均为25 μL，其中包括：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、去离子水8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL(第1轮PCR产物为第2轮模板)。通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测第2套巢式PCR产物，放置于凝胶成像仪内，使用Image Lab软件成像拍照。

1.5 测序及分析

将PCR产物阳性者送至英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，测序结果在GenBank中BLAST比对校正后提交至NCBI。将校正后序列与NCBI上参考序列使用Clustal X比对，使用MEGA 6的NJ法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 断奶前犊牛贾第虫感染情况

PCR扩增结果显示，278份样品中有26份样品为贾第虫阳性，总感染率为9.35%(26/278)。在10个采样地区中，6个地点检测出贾第虫感染阳性，感染率在7.69%～46.43%之间。基于bg、tpi和gdh基因位点进行PCR扩增，分别扩增26、24、24条序列。经序列比对鉴定，均为集聚体E。将序列提交至NCBI获得登录号(MF671870-MF671908)。

2.2 基因序列分析

在NCBI中搜索bg、tpi和gdh相关参考序列，采用MEGA 6将参考序列与本次研究所得序列进行同源性分析。基于bg基因位点(图1)，26条序列形成7种基因亚型，其中4种基因亚型为已知亚型，其序列分别参考KT922247、KY769091、KY769093和KT698677。其余3种为新基因亚型，分别为E13(MF671880)、E14(MF671883)和E16(MF671886)。7种基因亚型中，以E1(n=8)基因亚型为主。

基于tpi基因位点(图2)，24条序列形成7种基因亚型，其中5种基因亚型为已知亚型，序列参考为KT922261、KT922259、EF654690、KY432848和KY769103。其余2种为新基因亚型，分别为E21(MF671904)和E24(MF671907)。其中以E3(n=13)基因亚型为主。

•，本实验所得序列，下同。•，Sequence in this study. The same below.图1 断奶前犊牛贾第虫bg基因位点系统进化发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on bg gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

图2 断奶前犊牛贾第虫 tpi基因位点系统进化发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on tpi gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

基于gdh基因位点(图3)，24条序列同样形成7种基因亚型，其中5种为已知基因亚型，序列参考为KY769096、KT369780、KT368785、KT698971和KY432838。其余2种为新基因亚型：E18(MF671896)和E19(MF671899)。其中以E1(n=9)基因亚型为主。

本研究中，26份贾第虫阳性样品基于各基因位点均分别发现7种基因亚型，具体分型结果见表1。

图3 断奶前犊牛贾第虫gdh基因位点系统进化发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on gdh gene sequence of G. duodenalis in pre-weaned dairy calves

3 讨论

断奶前犊奶牛贾第虫感染在我国各地区广泛存在，具有较高的感染率。有研究表明，我国西北、中部、东北、东南部分地区感染率分别为9.7%(23/237)[20]、17.6%(89/505)[11]、13.3%(36/271)[14]、60.1%(492/818)[16]。而在西部地区，目前对四川地区暂未见相关报道。因此，对四川地区断奶前犊牛贾第虫感染情况的调查，有利于了解四川地区奶牛贾第虫感染情况，同时也有利于研究贾第虫这类人畜共患病的风险评估。本研究结果表明，四川部分地区断奶前犊牛贾第虫总感染率为9.35%(26/278)，较我国中部、东北、东南地区感染率低，与西北部分地区感染率接近，表明不同地区断奶前犊牛贾第虫感染率存在地区差异。本研究中，10个采样地区有6个地区检测出贾第虫阳性(感染率0%～46.43%不等)，表明不同养殖场的感染率仍存在差异。其原因可能与每个养殖场的饲养密度、管理方式等因素有关，且部分养殖场断奶前犊牛通常未进行分栏饲养，以群养为主，增加贾第虫在奶牛之间的传染概率[16]。

目前国内奶牛贾第虫感染主要以集聚体A和集聚体E为主，呈混合感染。根据不同的基因位点，检测出的基因型可能不同，因此在对某一地区进行贾第虫虫种鉴定时，常采用多位点基因鉴定以提高基因型鉴定、混合感染及序列多态性分析的准确性[21]。目前，贾第虫虫种的鉴定常采用包括16S rRNA、tpi、gdh和β-giaidin等[22]。之前研究表明，我国河南省、东北地区、宁夏回族自治区奶牛感染贾第虫以集聚体E为主[12，15，23]，同时也发现有集聚体A[12，23]、集聚体B感染[12，15]和集聚体A/E混合感染[12]。本研究基于bg、tpi和gdh三个基因位点，对四川地区断奶前犊牛贾第虫感染情况进行检测，分别扩增出26、24，24条序列 ，经序列比对鉴定，均为集聚体E，分别以E1(n=8)、E3(n=13)，E1(n=9)基因亚型为主。提示四川地区断奶前犊牛贾第虫基因型与其他地区存在一定差异。基于tpi、gdh和β-giaidin基因位点均分别鉴定出7种亚型，并基于3种不同位点共发现了7种新基因亚型，表明四川地区贾第虫虫种的遗传多样性较高，各基因位点序列差异较大。

本研究首次采用多位点基因序列分析法对四川部分地区犊牛贾第虫感染情况及基因分型进行研究。四川地区断奶前犊牛贾第虫主要以集聚体E为主。本次试验虽然未检测出人兽共患集聚体A和B，但6个地区均检测出集聚体E，表明四川地区犊牛感染贾第虫形势仍然严重。在今后日常生产管理中，仍需加强奶牛的饲养管理，定期驱虫，做好粪便处理工作，避免带有感染性包囊的粪便污染水源及周边环境。同时，应继续对四川地区犊牛贾第虫感染进行长期的监测，以确保家畜以及人类的健康。