PTCH1基因rs28377268多态性与骨质疏松性椎体压缩骨折骨代谢标志物的相关性研究

唐冲 刘正 吴四军 王其飞 郑繁荣 张光武*

1. 北京大学首钢医院骨科， 北京 100144 2. 浙江台州市中心医院骨科， 浙江 台州 318000

骨质疏松症是一种以骨量减少为特征的全身骨代谢性疾病，导致骨组织微结构退化，增加骨脆性和骨折易感性。随着社会老龄化，骨质疏松症的发病率逐年升高，导致患者出现慢性骨质疏松性疼痛，并可因低能量损伤出现骨质疏松性骨折，增加病人致残率及死亡率，增加社会医疗成本，已成为全球关注的公共健康问题[1-3]。近些年来，全基因组相关研究已证实，至少有60多个基因位点与骨质疏松症相关[4,5]，其中PTCH1基因的rs28 377 268位点突变可导致脊柱骨密度降低、增加骨质疏松性骨折风险[6]。而关于该基因位点与骨代谢标志物浓度之间的关系尚无相关报道。本文将探究PTCH1基因的rs28 377 268位点等位基因频率和基因型频率在老年骨质疏松人群中的分布特点，并探讨该基因位点多态性与骨代谢标志物的相关性，有助于我们从基因水平、骨代谢状况阐明老年性骨质疏松性骨折的发病机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

对象资料：选取2016年1月至2016年6月北京大学首钢医院骨科脊柱组收治的160例患者，其中骨质疏松性椎体压缩骨折患者(骨折组)和脊柱退行性病变(包括颈椎病、腰椎间盘突出、腰椎管狭窄腰椎滑脱等)骨质疏松患者(对照组)各80例。骨折组中男性28例，女性52例，平均年龄(75.2±8.9)岁。对照组中男性37例，女性43例，平均年龄(73.7±8.5)岁。测量并计算每位患者的骨密度(bone mineral density，BMD)及体重指数(body mass index，BMI),骨折组和对照组在性别、年龄、BMD及BMI上均无统计学差异(P>0.05)(见表1)。本研究通过医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

纳入标准：(1)年龄：男性≥60岁，女性≥55岁；(2)骨密度：T值≤-2.5；(3)骨折组均为低能量损伤，病史、查体及影像学检查证实为椎体压缩骨折；(4)患者意识清晰，理解本研究目的及要求，同意并签署书面知情同意书。

排除标准：(1)年龄：男性<60岁，女性<55岁；(2)骨密度：T值>-2.5；(3)高能量损伤导致的椎体骨折；(4)患者不能或拒绝签署书面知情同意书；(5)长期服用影响骨代谢药物史，如类固醇类激素等；(6)患有影响骨代谢的疾病，如糖尿病、甲状旁腺功能亢进、恶性肿瘤、类风湿等；(7)有严重肝、肾、胃肠等重要脏器疾病；(8)存在影响BMD测量的因素，如脊柱手术史。

1.2 研究方法

1.2.1骨密度测定[7]：采用双能X线骨密度测定仪测量腰椎L1～L4椎体骨密度。

1.2.2骨转换标志物测定：采空腹静脉血2 mL，用罗氏全自动化学发光免疫分析仪及试剂盒检测骨钙素(osteocalcin,OC)、Ⅰ型胶原羧基端肽β特殊序列(beta-crosslaps of type I collagen cross-linked C-telopeptide,β-CTX)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(procollagen I N-terminal propeptide,P1NP)、25-羟维生素D(25-hydroxyvitamin D,25(OH)D)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)浓度。

1.2.3SNP分型：清晨空腹时采集肘静脉血2 mL于EDTA抗凝管中，置于-80 ℃冰箱保存。采用酚/氯仿法提取外周血白细胞DNA, -20 ℃保存。上海生物工程技术有限公司合成PTCH1基因rs28 377 268位点引物：上游引物：5′-GGGTAAATTTGGATCCGATTGAG-3′，下游引物：5′-TGGTTTTGATTACTGAGGCCAAG-3′。采用SNaPshot技术基因分型。核心反应(即延伸反应)体系中包含：测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧挨多态位点5′-端的不同长度延伸引物、包含SNP位点的PCR产物模板。

1.3 统计学处理

2 结果

如表1所示，本研究中160例研究对象的SNP检出率为100%，其中骨折组及对照组G、T等位基因频率均为128(80%)、32(20%)，GG、GT、TT基因型频率分别为53(66.25%)、22(27.50%)、5(6.25%)和50(62.50%)、28(35.00%)、2(2.5%)，两组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。骨折组和对照组的等位基因频率及基因型频率分布均无统计学意义(P>0.05)。

在骨转换标志物方面，骨折组中血清OC、PINP、β-CTX 及25(OH)D浓度较对照组均无统计学意义，而PTH浓度明显高于对照组(P<0.05)(见表1)。另外，血清OC、PINP、β-CTX 及25(OH)D 浓度在GG、GT、TT3种基因型之间亦无统计学意义(P>0.05)，而总体及骨折组血清PTH浓度在GT、TT基因型中均高于GG基因型，其中TT基因型显著高于GG、GT基因型(P<0.05)。

表1 两组患者的基本信息、PTCH1基因及骨代谢标志物比较Table 1 Comparison of basic information, PTCH1 gene and bone metabolic markers between the two groups

3 讨论

原发性骨质疏松症是绝经后女性及老年男性最常见的全身性骨代谢疾病，以骨量丢失、骨微结构破坏、骨骼脆性增加和骨折风险上升为特点[8]。骨质疏松性椎体压缩骨折(osteoporotic vertebral compression fractures，OVCFs)是由于老年人罹患骨质疏松症后，骨密度及骨强度明显降低，受到轻微暴力甚至在日常活动中发生的胸腰椎骨折，是骨质疏松症最严重的并发症，其中70岁以上人群OVCFs的发生率高达20%，且随年龄增加而增加[2,3,9,10]。临床上，除了用骨密度检测作为诊断骨质疏松症的金标准外，常使用骨代谢标志物反映骨代谢的病理生理变化，包括骨代谢调控激素和骨转换标志物，其中骨代谢调控激素包括维生素D和PTH，而PINP和β-CTX则是骨形成和骨吸收的首选骨转换标志物，被国际骨质疏松基金会推荐为骨质疏松疗效检测的重要指标[11]。

表2 血清骨代谢标志物在三种基因型之间的比较Table 2 Comparison of serum bone metabolic markers between the three

Hedgehog(Hh)信号通道是调控个体发育过程的重要通路,其在软骨内骨化过程中通过Indian Hedgedog(IHH)调控成骨细胞分化，对成骨细胞的形成起着不可或缺的作用[12,13]。IHH结合功能性跨膜蛋白受体Ptched1(PTCH1)后通过跨膜蛋白Smoothened(SMO)激活信号通道，抑制蛋白水解切割的GLI3阻遏物(GLI3R)的产生并促进全长GLI2激活物(GLI2A)的产生，促进RUNX2+OSX+细胞形成，从而刺激成骨细胞分化，故PTCH1等位基因出现突变时将会影响成骨过程[14-16]。Styrkarsdottir等[6]证实rs28 377 268位点位于PTCH1基因的15号内含子，其次要等位基因可导致脊柱骨密度降低、增加骨质疏松性骨折风险(OR=1.09)。然而目前尚无中国人该位点的基因及基因型频率报告，以及其多态性与老年人骨代谢标志物关系的相关性研究。

本研究中，骨折组和对照组PTCH1基因rs28 377 268位点的G、T等位基因频率均为80%、20%，GG、GT、TT基因型频率分别为66.25%、27.50%、6.25%和62.50%、35.00%、2.5%，两组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，提示本研究对象的人群遗传稳定、研究数据可靠。两组间的基因频率及基因型频率均无统计学意义，两组中等位基因T的频率相对于Styrkarsdottir等的报道(11.4%～22.6%)无明显差异，而GT基因型频率明显高于16.71%[6]，提示该位点等位基因频率在不同区域和种族无明显差异，而基因型频率分布存在区域差异和种族差异。

在本研究中骨折组血清中的OC、PINP、β-CTX及25(OH)D浓度相对于对照组均无统计学意义，而PTH浓度明显高于对照组(P<0.05)，提示骨质疏松性椎体压缩骨折患者的甲状旁腺激素浓度较高，作用于破骨细胞，使骨吸收作用大于骨形成作用，导致骨量丢失，在低能量损伤时易发生脆性骨折。另外四项骨代谢标志物可能由于半衰期相对较长、代谢途径不同，在两组间未能体现出差异，如果增加病例数或延迟血生化检测时间可能会出现结果差异。两组患者中骨密度无明显差异可能与样本量较小相关。在三种基因型比较方面，因对照组中TT基因型例数仅2例，未进行单因素方差分析，故我们发现GG、GT、TT三种基因型在OC、PINP、β-CTX及25(OH)D四项骨代谢标志物上亦无明显统计学差异，而TT基因型的血清PTH浓度明显高于GG、GT基因型(P<0.05)，且GT基因型的PTH浓度亦略高于GG基因型，提示等位基因T在血清PTH浓度方面起一定作用，可能T等位基因表达抑制了IHH与PTCH1的结合，IHH浓度升高，而IHH可刺激甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)的表达，PTHrP与PTH具有相同受体，PTHrP竞争PTH受体，致使血清中PTH增加[17,18]。此外，PTHrP、PTH共同作用于破骨细胞，促进骨吸收，导致骨质疏松，增加骨质疏松脆性骨折风险。

4 结论

综上所述，PTCH1基因rs28 377 268位点在骨质疏松患者中G、T等位基因的表达频率分别为80%、20%，基因频率及基因型频率在脊柱骨折组和对照组间无明显差异。脊柱骨折患者的血清PTH浓度明显高于对照组，且GT、TT基因型的血清PTH浓度均高于GG基因型，其中TT基因型显著高于GG、GT基因型(P<0.05)，提示rs28377268-T等位基因高表达可能间接升高血清PTH浓度，促进骨质疏松发生，增加椎体脆性骨折风险。