木霉融合子Tpf-2的定殖及其对番茄防御酶系的影响

李纪顺, 陈 凯, 李 玲, 赵忠娟, 杨玉忠, 杨合同

(齐鲁工业大学(山东省科学院),山东省科学院生态研究所, 山东省应用微生物重点实验室, 济南 250103)

番茄猝倒病(tomato damping-off)是番茄苗期重要的毁灭性病害,多发生在苗床前期,感病幼苗易倒伏死亡,造成约60%的减产[1-2]。病原菌为卵菌门鞭毛菌亚门中的腐霉属Pythiumspp.低等真菌,常以卵孢子生存繁殖,可在土中、水中腐生或寄生存活较长一段时间[3-4]。防治番茄猝倒病的主要方法是采用化学杀菌剂,但由于过量和不合理使用化学农药防治病害带来的一系列健康和环境问题,安全的生物防治越来越受到重视和应用[5-7]。

目前防治番茄猝倒病的生防菌种类主要包括芽胞杆菌和木霉[8-10],木霉因生长速度快、产孢能力强、分布广泛、并具有细胞壁降解酶活性和代谢产生大量的抗生性物质而得到广泛关注,但由于自然来源的木霉菌株田间应用效果不够理想,制约了其进一步推广应用[11-13]。利用现代生物技术对菌株进行改良选育,是获得高效多功能生防菌株的有效手段[14-15]。本实验室前期利用原生质体融合技术,选育得到1株木霉融合子Tpf-2,该融合子综合生防性状较好,温室条件下对番茄猝倒病的防治效果达到85.0%以上,并可产生丰富的厚垣孢子[16]。厚垣孢子是木霉在逆境下产生的一种繁殖体,该类孢子在储存、萌发及在逆境下的存活能力均远远优于分生孢子,田间应用时表现出较强的抗逆性[17],故以木霉融合子Tpf-2的厚垣孢子为有效成分制备微生物制剂进行病害防治,具有较好的应用前景。

木霉与植物的互作是一个复杂的过程,生防菌能否在靶标植物体内及其根际适应并定殖存活是筛选、评价土传病害生防菌的重要指标[18],植物体内参与生理代谢过程多种防御反应酶与植物抵抗病原菌入侵也有密切关系[19-20]。本文以前期生防效果较好的木霉融合子Tpf-2为试验菌株,重点研究接种病原菌瓜果腐霉P.aphanidermatum后,融合子Tpf-2在番茄根际土中的定殖动态,及对番茄叶片中相关防御酶的诱导活性,旨在探索供试菌株对番茄猝倒病的生防潜力及其与番茄植株诱导抗性的关系,进而为抗番茄猝倒病生防真菌的筛选及生防机理研究提供科学依据,为制剂改进和防效评价提供支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株与材料

供试菌株为木霉融合子Tpf-2,生防制剂为其厚垣孢子可湿性粉剂,有效成分含量为2亿/g。病原真菌为瓜果腐霉P.aphanidermatumAcu36125,购自中国农业微生物菌种保藏管理中心,病原真菌在PDA平板上培养后,用无菌打孔器打取直径5 mm的菌块备用。番茄品种为日本‘京宝’,购自济南大江种子有限公司。

1.2 试剂与仪器

Powersoil DNA Isolation Kit试剂盒,MoBio公司;Roche Light Cycler96荧光定量仪,罗氏诊断产品(上海)有限公司;TransStart Top Green qPCR SuperMix,Trans15K DNA Marker,北京全式金有限公司;DL2000 DNA Marker,TaKaRa公司;普析TU-1810紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司。

1.3 温室试验

温室试验设4个处理:清水对照(CK)、瓜果腐霉P.aphanidermatum(Pa)、木霉融合子Tpf-2(Tpf-2)、木霉融合子Tpf-2+瓜果腐霉P.aphanidermatum(Tpf-2+Pa)。

试验用土为大田健康土,番茄种子于25℃催芽至露白。播种时,CK处理组每盆放置10粒种子;Pa处理组每盆接入2块瓜果腐霉菌块,并放置10粒种子;Tpf-2处理组每盆放置10粒种子,种子上均匀撒入55 mg的Tpf-2制剂;Tpf-2+Pa处理组每盆接入2块瓜果腐霉菌块,并放置10粒种子,种子上均匀撒入55 mg的Tpf-2制剂。每个处理组种植21盆。

在人工气候室内于光暗周期为10 h∥14 h,昼夜温度为25℃∥18℃,空气相对湿度为50%～70%的条件下,对盆栽样品进行管理,各处理和对照分别于播种后15、30、45、60、90、120、150 d取样检测Tpf-2在番茄根际土中的定殖动态,并于播种后60 d取样检测番茄叶片相关防御酶活性,每次取样设3个重复。

1.4 木霉融合子Tpf-2在番茄根际土中的定殖动态检测

取样时,将番茄根部小心地拔出,抖掉表层土,收集根际土,放入自封袋内带回实验室,土壤微生物基因组总DNA采用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒进行提取,-20℃保存备用。

前期试验表明,木霉融合子Tpf-2的Tef1区与已知木霉种类的Tef1区差异较大,同源性低于95.0%,本文以Tpf-2的Tef1区设计特异基因片段引物,Tef1F:5′-GTTTTCGTCACCCCGCTTCC-3′,Tef1R: 5′-GTGGCAGAGCAGGGCAAAAGA-3′,以微管蛋白β-tubulin基因为内参,基因片段引物为TubF:5′-GAAGATGTCGTCCACCTTTATT-3′,TubR:5′-GTGAACTCCATCTCGTCCAT-3′。以不同土壤DNA样品为模板,首先利用常规PCR检测引物的特异性,并通过qPCR检测木霉融合子Tpf-2的定殖动态,每个样品重复3次。

qPCR采用20 μL反应体系:2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL,10 μmol/L引物各0.4 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 8.2 μL。qPCR扩增条件:94℃预变性30 s;94℃变性5 s,60℃退火15 s,72℃延伸10 s,40个循环;按0.1℃/s升温速率从65℃升至95℃,每升高0.5℃检测1次荧光信号,进行熔解曲线分析。以木霉融合子Tpf-2处理组播种后150 d取样样品为标准样品,利用2-ΔΔCt计算样品中目的基因的相对定量结果[21],其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因,ΔΔCt=ΔCt试验样品-ΔCt标准样品。

1.5 木霉融合子Tpf-2诱导番茄叶片防御酶活性检测

番茄幼苗期是番茄发育的重要时期,这一阶段子叶和真叶生长得好坏直接影响番茄进一步的生长发育,本试验选取种植60 d的番茄叶片进行防御酶活性检测,主要检测超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD及过氧化氢酶CAT活性的变化[22-24],每个处理设3个重复。

酶活性计算:SOD活性单位以抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%所需酶量为1个酶活单位(U),SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(U·g-1);POD以每分钟吸光度变化值(ΔA470)表示酶活力的大小(U·g-1·min-1);CAT以每分钟吸光度变化值(ΔA240)表示酶活性大小(U·g-1·min-1)。

1.6 统计方法

用SPSS 19.0统计软件中的邓肯氏(Duncan’ s)方法对数据进行分析,结果为3次重复的平均值±标准差,以不同大写字母表示在0.01水平上存在极显著性差异,以不同小写字母表示在0.05水平上存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 木霉融合子Tpf-2的定殖动态检测

2.1.1 土样DNA提取与检测

利用PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒提取土样中的DNA,琼脂糖凝胶电泳检测DNA条带,结果见图1,不同处理,不同取样时间采集的各土样中均可提取到微生物总DNA。

图1 土样DNA电泳图谱Fig.1 The electrophoretogram of soil DNA

2.1.2 引物特异性检测

用设计的目的基因引物Tef1F/Tef1R及内参基因引物TubF/TubR对第一次取样(15 d)的土样DNA样品进行PCR扩增,结果见图2。用内参基因引物TubF/TubR扩增时,4个处理中均扩增出大小144 bp的条带,说明所有土样中均有真菌DNA的存在。用目的基因引物Tef1F/Tef1R扩增时,CK和Pa中未扩增到条带,而Tpf-2和Tpf-2+Pa则扩增出大小159 bp的目的条带,说明设计的目的基因引物具有特异性和高度准确性,可以利用该引物进行后续的定量分析检测。

2.1.3 木霉融合子Tpf-2的定殖动态

利用荧光定量qPCR检测木霉融合子Tpf-2厚垣孢子在番茄根际土中的定殖动态,结果见图3。整个番茄生育周期内(0～150 d),Tpf-2和Tpf-2+Pa处理组中均检测到木霉融合子Tpf-2的定殖,说明木霉融合子Tpf-2的厚垣孢子可在番茄根际土中长期存活。两种处理下,木霉融合子Tpf-2的相对定殖数量随时间的延长呈下降趋势,并且在同一取样时间点上,Tpf-2+Pa处理组中木霉融合子Tpf-2的定殖数量高于Tpf-2处理组的定殖数量,说明瓜果腐霉刺激了木霉融合子Tpf-2的定殖。

图2 目的基因引物与内参基因引物对不同处理 土样DNA的PCR扩增图谱Fig.2 Amplification of DNA from different treatments by specific primers Tef1F/Tef1R or internal reference primers TubF/TubR

图3 木霉融合子Tpf-2在番茄根际土中的qPCR结果Fig.3 qPCR analysis of Trichoderma fusant Tpf-2 colonization in tomato rhizosphere soils

2.2 木霉融合子Tpf-2诱导番茄叶片防御酶活性结果

番茄幼苗期(60 d)叶片中3种防御酶SOD、POD及CAT在不同处理下的活性变化如图4所示。

与对照CK相比,其他3组处理均能提高番茄叶片中SOD、POD及CAT的活性,但Pa处理组与CK在0.05水平上无显著性差异,说明瓜果腐霉P.aphanidermatum对3种防御酶的活性影响不大。

Tpf-2及Tpf-2+Pa处理组与CK及Pa处理组间存在极显著性差异(P<0.01),说明木霉融合子Tpf-2可显著提高番茄叶片中SOD、POD及CAT的活性。

4组处理中,Tpf-2+Pa处理组的SOD、POD及CAT酶活性影响效应最大,对SOD的诱导效果与Tpf-2处理组间存在显著性差异(P<0.05),说明病原真菌P.aphanidermatum的存在,可显著提高木霉融合子Tpf-2对番茄叶片SOD酶的诱导效果;对POD和CAT的诱导效果,Tpf-2与Tpf-2+Pa处理组间存在极显著性差异(P<0.01),说明在瓜果腐霉P.aphanidermatum存在的情况下,木霉融合子Tpf-2可极显著诱导番茄叶片POD和CAT活性的提高。

图4 木霉融合子Tpf-2诱导对番茄叶片防御酶活性的影响Fig.4 Defense enzyme activities of tomato leaf after inoculated with Trichoderma fusant Tpf-2

3 讨论

能否在植物上成功定殖是评价生防菌的一个重要指标,传统方法是对其进行平板稀释计数,但是此方法费时费工,并且灵敏度不高。而实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,qPCR)技术因其操作简单,特异性高等优点被应用到环境中不同木霉菌的检测[25-26]。

本试验用到的生防菌株为木霉融合子Tpf-2,经序列分析表明,该融合子的Tef1区与已知木霉其他种类的Tef1区序列差别较大,故以此设计特异引物对目的样品进行PCR扩增和定量分析,排除了土壤中其他木霉及其他真菌的干扰,保证了分析结果的准确性和可靠性。

相对定量结果表明:木霉融合子Tpf-2厚垣孢子可在番茄根际土中长期定殖,定殖周期不低于150 d,较以前报道的分生孢子的定殖时间不超过100 d[27]大幅延长。Tpf-2和病原菌联合处理后,Tpf-2定殖数量较不加病原菌的处理组呈增加趋势,说明病原菌可刺激Tpf-2的定殖量,为病害防治奠定了基础。前人报道指出,棘孢木霉T.asperellum在黄瓜根际的数量经历了低-高-低的动态变化,棘孢木霉施入土壤后有一个适应过程,一旦适应后,其定殖数量能够迅速上升[28]。本试验中Tpf-2厚垣孢子相对定殖数量随时间的延长呈降低趋势,说明Tpf-2厚垣孢子在番茄根际土中并没有产生明显的繁殖现象,本结论与文献报道的有所不同,具体原因有待进一步探讨。

木霉是一类能够诱导植物产生系统抗病性的生物因子,诱导宿主植物产生一系列局部或系统防御反应。防御反应与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等的活性提高关系密切[29-31]。木霉融合子Tpf-2可显著提高番茄叶片中SOD、POD及CAT的活性,在瓜果腐霉存在的情况下其诱导效果更显著,说明木霉在番茄遭受病原菌入侵后,能够对番茄中与抗病相关的3种酶CAT、SOD及POD活性的提高起到一定的诱导作用,从而间接使得植物体获得抗病作用。

综上所述,木霉融合子Tpf-2能够成功定殖在番茄根际,并且能有效诱导植物内在的生防反应物质,提高植物的抗病性。该研究为新的生防菌剂的开发研究奠定了一定的基础,有助于新型菌剂的开发利用。