单味中药水提物对鸡源耐药性E.coli地方株的体外抑菌活性研究

李蕴玉， 李佩国， 张召兴， 闫艳娟， 贾青辉， 常超越， 张香斋

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室， 河北 秦皇岛 066604)

鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(APEC)引起不同日龄的鸡发生气囊炎、肝周炎、心包炎、急性败血症等多种症状的总称。大肠杆菌是重要的条件致病菌，具有较多的血清型，不同的地区流行的血清型也不一样。由于抗生素在养鸡生产中的不合理使用，导致了大肠杆菌产生了很强的耐药性，同时也造成了药物残留，严重危害着人类的健康。

中药不仅对鸡致病性大肠杆菌具有直接或者间接的杀灭作用，清除致病性大肠杆菌在鸡体内产生的内毒素，还可以消除致病性大肠杆菌耐药质粒，降低耐药性[1]，并通过多个途径调整机体的免疫机能，从而增强机体的抵抗力，具有不易产生耐药性、低残留等优点[2]。有关中药防治鸡大肠杆菌病的相关报道较多，但中药对耐药性大肠杆菌的抑菌活性以及防治效果的报道较少。为此，本试验采用24种中药水提物对河北地区分离的鸡源耐药性E.coli地方流行株进行体外抑菌活性试验，筛选出敏感的中药，为进一步研究抗耐药性E.coli复方中药制剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 大肠杆菌标准质控菌株ATCC25922、河北地区鸡源耐药性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)，由河北省预防兽医学重点实验室保存。

1.2 试剂及仪器 五味子、黄连、金银花、诃子等24种中药(购自秦皇岛民乐医药有限公司)；普通营养培养基、营养肉汤均(购自北京奥博星生物技术有限责任公司)；1%红四氮唑、96孔细菌培养板(购自美国Corning公司)；隔水式恒温培养箱(由上海一恒科技仪器有限公司生产)；高速中药粉碎机(由青州市精诚医药装备制造有限公司生产)；常规的试剂与仪器由本实验提供。

1.3 菌液的计数 参考文献报道的方法[6]，取出-80 ℃保存大肠杆菌标准质控菌ATCC25922、河北地区鸡源耐药性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)菌种进行复苏，将复苏的菌种培养至对数生长期，利用平板菌落计数法进行菌落计数。

1.4 中药水提物的制备 用水提法制备中药水提物，取各单味中药100 g，粉碎后称重，加入8～10倍蒸馏水浸泡1 h，煮开后慢火煮20 min左右，12层纱布过滤，用同样方法再煮1次，过滤，合并2次煮的药液进行浓缩，使其浓度为1 g/mL，离心后调整pH值为7.2～7.4，121 ℃高压灭菌,4 ℃保存备用。

1.5 单味中药水提物体外抑菌圈直径的测定 采用平板琼脂打孔法方法，进行检测单味中药水提物体外抑菌圈直径的大小，判定标准：15 mm≤抑菌直径<20 mm为高敏；10 mm≤抑菌直径<15 mm为中敏;10 mm以下为低敏[3-4]。

1.6 单味中药水提物最小抑菌浓度(MIC)的测定 参照文献报道的改良微量二倍稀释法测定单味中药的MIC[5]。在96孔细菌培养板第1～11孔每孔加入100 μL营养肉汤，第1孔加入100 μL中药水提物药液(1g/mL)，倍比稀释到第9孔后弃100 μL，第10孔阴性对照孔，第11孔阳性对照孔，除第10孔外，每孔加10 μL菌液(108CFU/mL)，37 ℃培养24 h后，接种于普通培养基上，无菌生长的稀释梯度为该药的MIC。

2 结果

2.1 单味中药水提物体外抑菌圈直径测定结果 由表1可知，3株鸡耐药性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均对诃子、五味子、五倍子、黄连、黄芩、苦参6种中药高度敏感；分离株QH15(O2)、QH16(O38)对地丁高度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均对金银花、夏枯草、连翘3种中药中度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)对青皮中度敏感；QH17(O89)对女贞子中度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)对板蓝根、白头翁低敏；鱼腥草、大黄、黄柏等9种中药均无抑菌作用。

表1 单味中药对鸡耐药性E.coli地方株体外抑菌试验(mm)

-：无敏感性

2.2 单味中药水提物MIC测定结果 由表2可知，3株鸡耐药性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均对诃子、五味子、五倍子、黄连、黄芩、苦参6种药物的MIC在7.825～31.25 mg/mL之间；分离株QH15(O2)、QH16(O38)对地丁、青皮的MIC为31.25 mg/mL；3株鸡耐药性E.coli地方株均对苏木、金银花、夏枯草、连翘4种药物的MIC在62.5～125 mg/mL之间；3株鸡耐药性E.coli地方株均对板蓝根、白头翁2种药物的MIC在125～250 mg/mL之间。鱼腥草、大黄、黄柏等9种中药对标准菌株及3株鸡耐药性E.coli地方株均没有效果。

表2 单味中药对鸡耐药性E.coli地方株的MIC (mg/mL)

-：无敏感性

3 讨论

在本试验中，笔者采用琼脂扩散法和改良微量二倍稀释法测定了24种中药水提物对鸡源耐药性E.coli地方流行株的体外抑菌活性，结果表明，3株鸡耐药性E.coli地方株对诃子、五味子、五倍子、黄连、黄芩、苦参6种中药的抑菌圈直径在15～24 mm之间，MIC在7.825～31.25 mg/mL之间，均高度敏感；而分离株对QH15 (O2)、QH16(O38)对青皮的抑菌圈直径为13 mm，中度敏感，但MIC为31.25 mg/mL，说明这两种方法测定中药抑菌活性具有一定的相关性，同时也存在一定的差异性，与张赛奇等[5]报道相一致。

本次试验选取中药可以分为清热药、攻下药、收涩药、解表药、理气药等。24种中药对河北地区的3个不同血清型的鸡耐药性大肠杆菌地方流行株体外抑菌试验结果表明，诃子、五味子、五倍子、黄连、黄芩、苦参的抑菌效果明显，其共同点在于都具有清热燥湿、涩肠止泻的功用。金银花、夏枯草、连翘的抑菌效果次之，而鱼腥草、大黄、黄柏等则没有表现出抑菌效果。其结果与张立永[6]报道的通过对耐药性大肠杆菌优势血清型O1+O148流行株筛选出的敏感中药存在一定的差异性，其原因可能与鸡耐药性大肠杆菌流行的血清型、中药的生长环境及提取工艺有关。中药水提法提取中药有效成分过程中，由于加热可能使抑菌的物质的活性降低或者破坏，从而影响了抑菌效果。另外中药水提物还需要高压蒸汽灭菌，在灭菌的过程中也可能降低抑菌活性，影响抑菌效果。本试验为进一步研究抗耐药性E.coli组方中药制剂提供科学依据。