铁皮石斛对免疫抑制模型小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响

陈星星， 李 焰， 杨小燕， 杨守深， 林福新

(1.龙岩学院生命科学学院， 福建 龙岩 364012 ； 2.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心， 福建 龙岩 364012)

随着畜禽疾病的复杂性和多样性逐渐增加，养殖生产中为了防控疾病和提高生产性能，出现大量使用以抗生素为主的饲料添加剂、不合理免疫接种等问题，导致畜产品药物残留、免疫功能下降、耐药性增加，从而影响人类健康，同样给我国畜牧业造成的损失日趋严重。中药免疫增强剂由于结构复杂、成分多样和具备内在的多功能性，符合畜禽机体脏腑功能的相互协调和整体统一规律，能增强动物机体的免疫功能和提高生产力，并且部分兼备营养性作用功能较全面[1]。帅起义等[2]研究表明，中药免疫增强剂具有提升猪瘟疫苗免疫抗体的显著作用，提高猪群生产性能，是预防免疫抑制疾病的重要手段。张桂枝等[3]结果表明，复方中药免疫增强剂能够促进雏鸡免疫器官的发育，增强机体的细胞免疫功能。耿文学等[4]以VA5免疫增强剂显著提升猪伪狂犬病病毒灭活疫苗的免疫效果，对猪伪狂犬病灭活疫苗的免疫具有增强作用。

铁皮石斛是我国名贵中药，载于《神农本草经》，列为上品，又名黑节草、铁吊兰等。味甘，平，无毒。主伤中，除痹，强阴。久服厚肠胃，轻身延年之功效[5]。现代研究表明，其富含多糖、生物碱、微量元素和氨基酸等多种有效成分，主要有增强免疫力、促进消化、抗疲劳、抗肝损伤、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。脾脏是机体T、B淋巴细胞聚集的部位[6]。而T、B淋巴细胞是机体的免疫活性细胞，其分裂、增殖在机体发挥免疫系统功能上有着重要的作用[7]。铁皮石斛有补肝悦脾之功效，对免疫力也有提高作用。因此本试验研究铁皮石斛对免疫抑制模型小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响，为将其开发为畜禽免疫增强剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物配制 100 g铁皮石斛脱水晒干枝条，药材质量符合中华人民共和国兽药典(2005年版)的质量标准。采用传统水煎法：蒸馏水预先浸泡2 h，加热煎煮2次，第1次保持微沸30 min，过滤药液；药渣加温水再煮沸，保持微沸30 min，过滤药液；合并两次滤液，小火浓缩至1.0 g/mL(按照生药量计算)。于60目筛网过滤、装瓶、高压灭菌，于-20 ℃冰箱保存。

1.1.2 环磷酰胺的配制 将0.2 g环磷酰胺粉末与生理盐水按100 mg/kg进行稀释。

1.1.3 试验试剂 刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)，购自Sigma公司；胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、RPMI-1640培养基、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基偶氮唑盐(MTT)，购自Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化铵(NH4Cl)等均为国产分析纯试剂。青链霉素，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.1.4 主要设备 SW-CJ-1F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；T-DH型倒置显微镜，日本Nihon Kohden公司；3111型二氧化碳培养箱，美国Thermo公司；酶标仪，美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组 6周龄清洁级KM小鼠50只，体重18～22 g，全为雌性，购自上海斯莱克实验动物有限公司。随机分为对照组、免疫抑制组，每组25只。每组各设5个重复，每个重复5只小鼠。对照组给予腹腔注射等量的生理盐水，免疫抑制组给予腹腔注射环磷酰胺注射液(100 mg/kg·bw)。

对照组与免疫抑制组隔天分别注射生理盐水和环磷酰胺注射液，1日1次，剂量为100 mg/kg·bw，连续15 d，末次给药后取对照组和免疫抑制组的小鼠各2只，将小鼠空腹12 h之后，脱颈处死，75%酒精浸泡5 min，无菌取脾，放在盛有适量PBS的培养皿中，小心剪除脂肪与筋膜组织，置于200目筛网上，用无菌注射针针芯轻轻研磨，使细胞滤过筛网，收集细胞悬液，加入3 mL Tris-NH4Cl裂解红细胞，室温静置5 min，1 500 r/min离心10 min，弃去上清，用RPMI-1640培养液离心洗涤细胞2次，以除去剩余的Tris-NH4Cl。收集细胞悬液即为脾淋巴细胞。运用台盼蓝染色统计细胞活力。

1.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞体外培养

1.2.2.1 铁皮石斛对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用最佳浓度及最佳时间的选择 显微镜计数，使用RPMI-1640完全培养液将小鼠脾脏淋巴细胞稀释成2×106个/mL，分别加入96孔细胞培养板，每孔加入100 μL细胞悬液，加入不同浓度的铁皮石斛，最终体积均为200 μL/孔，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养。然后向每孔加入10 μL MTT反应4 h，弃上清，再向各孔加入150 μL DMSO，混匀，静置5 min，最后酶标仪测定OD570mm值。

1.2.2.2 铁皮石斛于体外对ConA/LPS介导的小鼠T/B淋巴细胞增殖的影响 分别将小鼠脾细胞悬液按照100 μL/孔加入到96孔板中。各样本设ConA孔、LPS孔、对照孔。ConA孔加入2 μL ConA(最终浓度为10 μg/mL)，LPS孔加入2 μL LPS(最终浓度为100 μg/mL)，对照孔不加入铁皮石斛，最终体积均为200 μL/孔。按照1.2.2.1方法培养细胞，MTT法测定各培养孔OD570mm值。

1.2.3 细胞增殖测定方法 采用MTT法测定细胞增殖情况，即在二氧化碳培养箱培养44 h后，每孔加入10 μL的MTT，继续放入二氧化碳培养箱培养4 h，吸弃上清，最后加入DMSO 150 μL/孔，混匀，静置5 min，于570nm波长测定OD值。

1.2.4 数据分析 数据采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、Duncan′s多重比较及配对样本t检验(置信区间95%)，结果以“平均数±标准差”表示，以P<0.05为差异显著，P>0.05表明数据差异不显著。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 由表1可知，不同作用浓度分析表明，铁皮石斛在终质量浓度5～405 μg/mL范围内均可促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，并且表现量效关系，其中在5～135 μg/mL范围内促进效果显著(P<0.05)。不同作用时间分析表明，在不同浓度铁皮石斛刺激24、48、72 h 后，小鼠脾脏淋巴细胞均有增殖，其中作用48 h增殖幅度最大，表明铁皮石斛作用48 h对淋巴细胞的增殖效果显著(P<0.05)。

表1 铁皮石斛对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用最佳浓度及最佳时间的选择

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),下表同

2.2 不同浓度铁皮石斛对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响 由表2可知，培养48 h后，对于免疫抑制组而言，在浓度为20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的铁皮石斛协同ConA刺激免疫抑制小鼠脾脏T淋巴细胞分裂增殖情况具有显著作用(P<0.05)，其中铁皮石斛浓度在20 μg/mL时最佳。从对照组来看，20 μg/mL铁皮石斛浓度与单纯ConA刺激正常小鼠脾脏T淋巴细胞增殖效果差异不显著(P>0.05)。对照组中，不同浓度的铁皮石斛组间进行比较，各组间均差异显著(P<0.05)，并在一定浓度范围内，随铁皮石斛浓度的增高，细胞分裂增殖效果有增加趋势。

表2 不同浓度铁皮石斛对免疫抑制、对照小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影响

2.3 不同浓度铁皮石斛对小鼠脾脏B淋巴细胞增殖的影响 由表3可知，培养48 h后，对于免疫抑制组而言，不同浓度的铁皮石斛+LPS组与LPS组单纯刺激相比差异显著(P<0.05)，各浓度铁皮石斛OD值均高于单纯LPS刺激。提示在体外培养条件下铁皮石斛能很好的协同LPS刺激免疫抑制小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖，以40 μg/mL浓度效果最佳。对于对照组而言，不同浓度的铁皮石斛进行组间比较，各组间均差异不显著(P>0.05)，不同浓度的铁皮石斛对LPS诱导的小鼠脾脏B淋巴细胞分裂增殖效果显著(P<0.05)。

表3 不同浓度铁皮石斛对免疫抑制、对照小鼠脾脏B淋巴细胞增殖的影响

3 讨论

本试验通过参考文献和预试验选择以100 mg/kg·bw，腹腔注射环磷酰胺，一日一次，隔天注射，连续15 d的方法建立免疫抑制模型小鼠，发现小鼠体重减轻、饮食减少、精神沉郁、行动迟缓等免疫抑制症状，与李焰等[8]报道相符。表明免疫抑制模型小鼠建立成功。

脾脏是体内最大的外周淋巴器官，含有大量的淋巴细胞，其中T淋巴细胞占35%～50%，B淋巴细胞占50%～65%，两者分别介导细胞免疫应答和体液免疫应答。淋巴细胞的增殖情况能直观的反映出机体免疫功能[9]。Con A 、LPS分别作为T 、B淋巴细胞的有丝分裂原，主要促进两者增殖与分化为淋巴母细胞，最终产生相应的效应细胞。本试验采用MTT法检测脾脏淋巴细胞的分裂增殖情况，MTT法于1983年首创，由Mosmann应用于鼠淋巴瘤细胞中研究IL-2等细胞因子对细胞存活和增殖的影响，MTT法具有重复性好、灵敏性高、操作简便、稳定性好等优点[10-11]，现已广泛应用于各个领域。胡庭俊等[12]运用MTT法测定细胞的增殖程度，研究发现，山豆根多糖能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖和分泌NO的作用。刘民等[13]在37 ℃培养条件下用MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖。

本次试验选取5个浓度梯度在不同培养时间条件下观察铁皮石斛对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响，由试验结果可知，铁皮石斛终质量浓度在5～135 μg/mL范围内细胞增殖作用显著(P<0.05)。作用48 h效果最为明显。因此本试验选取20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL三个浓度作为探讨铁皮石斛协同ConA、LPS刺激小鼠脾脏T、B淋巴细胞体外作用的最佳浓度。对于小鼠脾脏T淋巴细胞而言，3个铁皮石斛浓度均能促进免疫抑制组小鼠脾淋巴细胞的增殖(P<0.05)，其中浓度为20 μg/mL时，小鼠淋巴细胞的增值效果最佳，表明铁皮石斛能够协同ConA促进免疫抑制小鼠脾脏T淋巴细胞增殖，增强机体的细胞免疫功能。对照组中，不同浓度的铁皮石斛组间进行比较，各组间均差异显著(P<0.05)，并在一定浓度范围内，随铁皮石斛浓度的增高，细胞分裂增殖效果有增加趋势，铁皮石斛浓度为80 μg/mL时对于正常小鼠脾脏T淋巴细胞分裂增殖显著(P<0.05)。对于小鼠脾脏B淋巴细胞而言，铁皮石斛浓度为40 μg/mL时对免疫抑制小鼠脾脏B淋巴细胞增殖效果最佳。各浓度铁皮石斛OD值均高于单纯LPS刺激，且细胞增殖情况差异显著(P<0.05)，但对照组中三个铁皮石斛浓度差异不显著(P>0.05)。提示铁皮石斛协同LPS促进正常小鼠脾脏B淋巴细胞增殖，参与机体体液免疫，但最佳浓度还有待进一步的研究。

夏方等[14]研究发现是由地锦草、白头翁和黄连3味中药组方制成的地翁颗粒能促进小鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖。宋美芳等[15]研究结果表明，铁皮石斛多糖在一定的浓度范围内能提高小鼠的免疫活性，促进脾脏淋巴细胞中细胞因子的分泌。以上学者的研究发现为本次试验结果提供有力的佐证。

综上所述，在体外培养条件下，铁皮石斛协同LPS、ConA促进脾脏淋巴细胞增殖，加强机体的免疫功能，为铁皮石斛的开发成畜禽免疫增强剂提供基础和理论依据。