苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠脊髓中P53、MDM2及IL-17表达的影响

刘淑情，吕 莹，刘方洲，张慧君，张明亮，马雯迪，朱 琳

1)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052 2)河南省中医药研究所动物实验研究中心 郑州 450004

多发性硬化症是一种中枢神经系统自身免疫性疾病，其病理特点为非特异性的中枢神经系统炎症、轴突损伤和髓鞘脱失[1]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)为多发性硬化症的经典动物模型[2]。在EAE模型中，研究者们[3]发现Th17细胞群具有很强的促炎作用，白细胞介素17(IL-17)是其中主要的效应因子，可以有效介导中性粒细胞的兴奋过程，从而有效介导组织的炎症反应。核磷蛋白P53是细胞凋亡中的一个重要的调控因子，具有修复DNA损伤，调节细胞生长周期、凋亡、自噬等作用，以维持细胞正常功能[4]。 MDM2是P53的一个关键的负调控因子，主要通过调节P53的转录活性、稳定性及其自身的泛素化降解，维持细胞中P53水平[5-6]。

苦参素又名氧化苦参碱, 是一种从传统豆科植物苦豆草的种子或苦参的根中提取的生物碱[7]。前期研究[8-9]表明，苦参素能够明显改善EAE大、小鼠的临床症状。本研究观察了苦参素对EAE小鼠脊髓中P53、MDM2及IL-17表达的影响，探讨苦参素防治EAE的机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药物、试剂及仪器苦参素注射液(批号：150422304)，0.3 g/mL，购自江苏正大天晴药业有限公司。MOG35-55(批号：051716)、百日咳毒素(批号：P2980)购自美国Sigma公司，完全弗氏佐剂(批号：1001832048)购自美国BD公司；P53抗体、MDM2抗体、FITC标记的山羊抗小鼠IgG以及IL-17检测试剂盒均购自英国Abcam公司。仪器主要有CUT4062石蜡切片机、EG1150H石蜡包埋机、Bilon超声波细胞粉碎机、Thermo酶标仪、OLYMPUS病理图像采集成像系统、OLYMPUS倒置荧光显微镜。

1.2实验分组雌性C57BL/6小鼠45只，8～10周龄，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物批号：SCXK20120001。参照文献[10]方法制备EAE小鼠模型。将MOG35-55(10 mg)溶解于2 mL生理盐水中，与含有2.5 g/L结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂等体积混合，使用玻璃注射器将混合液在冰上反复抽打至完全混合，制成油包水型乳白色乳剂，静置10 min后无分层为合格。将45只小鼠随机分为正常组、模型组、治疗组3组，每组15只。模型组与治疗组小鼠使用戊巴比妥麻醉后，在脊柱背侧中线两侧，分四点皮下注射上述抗原乳剂进行免疫(0.2 mL/只)。在免疫第0天和第2天，3组小鼠均腹腔注射含200 ng百日咳毒素的PBS溶液。治疗组于免疫后第13天起腹腔注射苦参素200 mg/kg[9,11]，正常组和模型组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续给药10 d。

1.3EAE小鼠神经功能评估自免疫后第1天开始隔天记录模型组和治疗组小鼠神经功能评分。神经功能评分标准[12]：0分，没有任何临床症状；1分，尾部无力；2分，后肢无力；3分，后肢瘫痪；4分，前、后肢均瘫痪；5分，濒死状态或死亡。症状介于两者之间时采用±0.5分计。由两名观察者分别进行评分，取均值。

1.4组织病理学检查免疫后第23天，用预冷的生理盐水对小鼠进行心脏灌注，直至心脏变成土黄色。取脊髓腰膨大处在多聚甲醛中固定24 h，石蜡包埋，5 μm厚切片，4 ℃ 保存备用。剩余脊髓置于-80 ℃冰箱保存备用。对切片分别进行HE染色和勒克斯光蓝(LFB)髓鞘染色，显微镜下观察，参照文献[13]进行评分。HE染色炎症浸润评分：0，无炎症细胞；1，少量分散的炎症细胞；2，血管周围炎症细胞浸润，呈袖套样；3，大量血管袖套样病变。LFB染色脱髓鞘评分：0，无髓鞘脱失; 1，罕见髓鞘脱失；2，少量部位髓鞘脱失；3，大面积髓鞘脱失。使用 Image J 软件计算剩余白质面积。

1.5脊髓组织中P53和MDM2蛋白的检测切片后立即在60 ℃烘箱中烤片1.5 h，脱蜡、水化，然后依次用体积分数为100%、95%、70%和50%的乙醇冲洗5 min，PBS漂洗5 min×3次，然后抗原修复，再PBS冲洗5 min×3次。将玻片上的PBS擦拭干净，滴加封闭血清，常温放置30 min。甩掉血清，略干后，滴加一抗(稀释度1200)4 ℃冰箱中过夜。从冰箱中取出后室温放置30 min，用PBS冲洗5 min×3次，滴加荧光二抗常温放置15 min，用PBS漂洗5 min×3次，封片。荧光显微镜下观察染色结果并捕获图片，使用Image-Pro Plus 6.0软件对靶蛋白表达情况进行定量分析。

1.6脊髓组织中IL-17的检测取脊髓组织50～100 mg置入离心管中，按0.05 g/mL加入0.01 mol PBS溶液，用超声波细胞粉碎机制成乳白色混悬液，12 000 r/min离心10 min，收集上清，ELISA法检测IL-17含量，操作按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.7统计学处理实验数据采用SPSS 21.0进行统计分析。模型组与治疗组小鼠神经功能评分的比较采用重复测量数据的方差分析，炎症浸润评分和脱髓鞘评分的比较，采用两独立样本的t检验；3组小鼠剩余白质面积,P53、MDM2蛋白以及IL-17表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组小鼠症状表现正常组小鼠未表现出EAE症状。模型组小鼠在免疫后的第11天起相继发病，表现为皮毛松乱、精神不振、尾部张力消失、步态笨拙；随着症状逐渐加重，出现四肢无力、体重下降，继而全身瘫痪；症状严重时处于濒死状态。治疗组小鼠的症状亦逐渐加重，神经功能评分不断升高，但症状加重速度较模型组缓慢。与模型组相比，治疗组小鼠的神经功能评分降低(表1)。

2.2组织病理学表现结果见图1、表2。与正常组相比，模型组小鼠剩余白质面积减少，炎症浸润程度及脱髓鞘程度均增加；与模型组比较，治疗组小鼠炎症浸润评分和脱髓鞘评分均降低，剩余白质面积增加。

表1 模型组和治疗组小鼠神经功能评分的比较

F组间=40.352，F时间=82.134，F交互=5.421，P<0.001

A:治疗组；B：模型组；C：正常组；1 ：LFB染色(×200)；2：HE染色(×100)

表2 3组小鼠组织病理学表现的比较

*：与正常组比较，P<0.01；#：与模型组比较，P<0.01

2.3 3组小鼠脊髓中P53、MDM2蛋白及IL-17的表达结果见图2、表3。与正常组比较，模型组小鼠脊髓中P53表达降低，MDM2和IL-17表达升高；与模型组比较，治疗组小鼠P53表达增加，MDM2和IL-17表达下降。小鼠脊髓组织中IL-17与P53的表达呈负相关(r=-0.665，P<0.001)。

A：正常组；B：模型组；C：治疗组；1：P53；2：MDM2

表3 3组小鼠脊髓中P53、MDM2及IL-17蛋白表达的比较

*：与正常组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05

3 讨论

多发性硬化症主要的病理特征是中枢神经系统的髓鞘脱失和轴突损伤。在EAE疾病进程中，外周免疫细胞可通过血脑屏障进入中枢神经系统，经中枢神经系统抗原提呈细胞作用而引起免疫反应，进而促使炎症因子的释放，最终造成髓鞘的脱失[14]。促进中枢神经系统中炎症细胞的凋亡或抑制炎症细胞表达成为近年来多发性硬化症研究的热点。P53/MDM2作为炎症细胞凋亡中的一个重要的负反馈调节系统，在多发性硬化等中枢神经系统疾病中具有巨大的研究前景。

TH17细胞是在自身免疫疾病机制的研究中发现的，主要分泌IL-17。IL-17可以诱导多种促炎因子和趋化因子的表达, 与多种免疫应答性疾病紧密相关。研究[15]发现，给予EAE小鼠抗IL-17抗体处理后，麻痹症状得到延缓，并且已发生的麻痹明显减轻。本次实验结果显示，EAE小鼠脊髓中IL-17表达明显升高，而经过苦参素治疗的EAE小鼠脊髓中IL-17的表达显著降低。P53蛋白主要表达在炎症细胞，参与EAE的发病过程，其表达量与EAE症状评分呈正相关[16]。MDM2作为P53下游重要的负反馈调节因子，其表达量的多少与EAE的临床症状也紧密相关。本实验中，EAE小鼠脊髓内P53的表达较正常组明显降低，而MDM2的表达显著增加。推测小鼠在正常状态下，体内的炎症因子在P53的调控下可以被及时清除；当神经系统受到病理损伤等刺激后，P53的表达显著降低，导致炎症细胞不能被及时清除，积累到一定量后即引起脱髓鞘与轴索损伤。经苦参素治疗的EAE小鼠，其神经功能评分显著降低，同时炎症浸润及脱髓鞘得到有效缓解，P53表达升高，而MDM2的表达显著降低。通过相关分析发现，EAE小鼠脊髓中P53与IL-17的表达呈负相关。由此可见，P53可能通过调节T细胞的活性，抑制IL-17的表达，进而减轻了炎症细胞的浸润及脱髓鞘程度。

综上所述，苦参素可能通过调节P53/MDM2平衡，有效缓解EAE小鼠的临床症状，使炎症浸润和脱髓鞘程度显著减轻。