疏水化改性羟乙基纤维素两亲性聚合物的合成及自组装行为

杨 晓 旭， 张 丽， 刘 真 真， 王 兴， 郭 延 柱,2

( 1.大连工业大学 轻工与化学工程学院， 辽宁 大连 116034；2.华南理工大学 制浆造纸工程国家重点实验室， 广东 广州 510640 )

0 引 言

两亲性纤维素聚合物是一类新型的纤维素高附加值衍生物，其分子结构中因同时含有亲水基团和疏水基团，在水溶液中可通过自组装技术形成具有核壳结构的纳米胶束[1-2]。其中胶束内核由疏水性链段通过链段间的疏水作用力形成，可作为疏水性功能分子的纳米容器；胶束外壳由亲水性链段通过分子间氢键和范德华力相互作用形成，以溶剂化的形式包裹在疏水内核外面，为胶束提供稳定的外界环境[3-4]。由于聚合物胶束的亲水性外壳由纤维素及其衍生物等天然高分子材料组成，故其具有优异的生物可降解性和生物相容性，可作为紫杉醇[5-6]和吴茱萸碱[7-8]等疏水性抗癌药物的运输载体。

目前，关于两亲性纤维素聚合物的合成主要有3种途径：纤维素本体的疏水化改性、水溶性纤维素衍生物的疏水化改性和油溶性纤维素衍生物的亲水化改性。用于水溶性纤维素衍生物疏水化改性的原料包括羟乙基纤维素(HEC)、羧甲基纤维素(CMC)、羟丙基纤维素(HPC)、纤维素季铵盐(QC)，其中HEC[9]因具有结构稳定、生物相容性好、水溶性好、羟基含量较多等特点，在两亲性纤维素聚合物的制备中的研究最为广泛[10-12]。Jiang等[13]采用ROP法合成了HEC-g-PCL两亲性聚合物，在水溶液中聚合物自组装形成纳米胶束，且随着疏水单体用量的增加其临界胶束浓度不断减小，具体范围在0.4～1.5 mg/mL。Östmark等[14]合成了一种以HEC为主链的两亲性嵌段接枝共聚物(HEC-g-PCL-g-PAA)，AFM结果表明聚合物可自组装形成核壳结构的单分子胶束，胶束分布均匀无聚集现象且粒径在30～50 nm，在纳米载体、靶向治疗方面具有较好的应用价值。

本研究采用卤代烷烃(溴代十二烷和溴代十八烷)为疏水单体，对HEC进行疏水化改性合成一系列HMHEC聚合物。通过改变疏水单体种类和用量，在水溶液中得到了稳定性好的自组装纳米胶束，并探索纳米胶束对疏水性抗癌药物的包载效果。

1 实 验

1.1 实验原料和试剂

羟乙基纤维素(HEC)，摩尔取代度1.8，阿拉丁试剂有限公司，使用前于45 ℃真空干燥48 h以彻底除去水分。溴代十二烷(BD-12)，纯度大于99.0%；溴代十八烷(BD-18)，纯度大于97.0%；芘，纯度大于99.9%；紫杉醇(PTX)，纯度大于99.9%；吴茱萸碱(EVO)，纯度均大于99.9%；Sigmar公司。异丙醇、正己烷、氢氧化钠、丙酮以及磷钨酸，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

1.2 HMHEC聚合物的合成

称取1 g HEC分散于6 mL异丙醇溶液中，氮气保护下，25 ℃水浴磁力搅拌30 min。将质量分数为5%的活化剂NaOH溶液逐滴加入该混合液中，磁力搅拌24 h使HEC完全润胀。将定量的BD-12/异丙醇或BD-18/异丙醇溶液逐滴加入上述溶液中，80 ℃下搅拌反应5 h。反应结束后，将反应体系冷却至室温，产物经正己烷浸泡过夜后，抽滤得到的沉淀分别用体积比为80%、90%、100%丙酮溶液进行依次浸泡抽滤，最终产物HMHEC用冰醋酸调至pH为7～8后，45 ℃真空干燥12 h得到HMHEC产品。

1.3 HMHEC纳米胶束的制备

准确称取100 mg HMHEC聚合物于10 mL超纯水中，在超声清洗机中超声分散30 min。超声条件：功率75 W，超声2 s停1 s，经0.22 μm滤头过滤得到HMHEC聚合物纳米胶束水溶液。

1.4 HMHEC聚合物及自组装纳米胶束的表征

1.4.1 傅里叶红外光谱(FT-IR)表征

准确称取2 mg样品与200 mg KBr混合均匀，研磨压片后在光谱仪上扫描，纯KBr压片为背景扫描，扫描范围400～4 000 cm-1。

1.4.2 氢核磁共振光谱(1H-NMR)表征

1H-NMR核磁谱图在Bruker AV-Ⅲ 400M上获得，样品质量浓度为20 mg/mL，溶剂为D2O-d6，测试内标为三甲基硅烷(TMS)。

1.4.3 热重分析(TGA)

利用Q500型的热重分析仪对样品的热稳定性进行表征，样品质量5～10 mg，测试温度范围室温至600 ℃，升温速率10 ℃/min，氮气保护，体积流量30 mL/min。

1.4.4 临界胶束浓度(CMC)表征

HMHEC聚合物的CMC值采用芘荧光探针法进行测定。具体操作：配制10 mg/mL的HMHEC 聚合物纳米胶束水溶液，采用逐级稀释法制得质量浓度分别为1、0.5、0.1、0.050 0、0.010 0、0.005 0、0.001 0、0.000 1 mg/mL的纳米胶束水溶液，准确移取50 μL的芘/丙酮溶液(0.6 μmol/L)，搅拌下加入至5 mL不同浓度的胶束水溶液中，经漩涡振荡混合器混合均匀后，置于超声波清洗机内超声2 h，以辅助探针芘进入胶束内核。将该溶液置于37 ℃水浴摇床中振荡过夜，使丙酮完全挥发，待结束后冷却至室温进行测定。在LS-55型荧光光谱仪上进行光谱测量，测试条件：激发波长339 nm，扫描范围360～550 nm，激发和发射狭缝宽度分别为10和5 nm。

1.4.5 粒径和Zeta电位测定

HMHEC纳米胶束的粒径大小和Zeta电位采用Nano ZS90型纳米粒度仪进行测量。测定粒径时，胶束质量浓度为0.1 mg/mL；测定Zeta电位时，胶束的质量浓度为1 mg/mL。测试前需将样品置于超声波清洗机内超声分散30 min，用0.22 μm 的滤头过滤除去胶束聚集体。每个样品重复测量5次，得到平均粒径(Rh)。

1.4.6 透射电镜(TEM)表征

HMHEC纳米胶束的形貌采用JEM-2100型透射电子显微镜进行表征。取一滴HMHEC纳米胶束水溶液(0.1 mg/mL)置于200目镀碳膜铜网上，用2%的磷钨酸溶液染色3 min，50 ℃真空干燥10 min。测试条件：加速电压200 kV。

1.5 HMHEC纳米胶束对PTX或EVO的包载及包封率的测定

配制1.0～4.0 μg/mL的PTX/乙醇溶液，利用紫外可见光分光光度仪测量不同浓度PTX溶液在227 nm处的吸光度。吸光度(A)和PTX/乙醇溶液浓度(C)的关系为：A=0.156 5C+0.077 1，其中线性相关系数R2=0.982 2。EVO/乙醇溶液的标准曲线绘制方法同PTX。EVO的最大吸收波长为224 nm，吸光度(A)和EVO/乙醇溶液浓度(C)的关系为：A=0.159C+0.052 7，其中线性相关系数R2=0.997 6。

2 结果与讨论

2.1 HMHEC的合成与表征

采用HEC为原料，在异丙醇溶液中以BD-12和BD-18为疏水单体，在氢氧化钠活化下，合成了一系列长碳链疏水化改性羟乙基纤维素聚合物(HMHEC)，结构和合成路线如图1所示。由表1可以看出，随着单体用量由40%增加至200%，HMHEC聚合物在水和有机溶剂(DMSO)中的溶解性能降低。在单体用量为80%时溶解性能达到最大，而在单体用量为200%时，HMHEC完全不溶，故采用HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ聚合物与HEC进行对比，分析其结构及性能方面的变化。

图1 HMHEC聚合物的合成路线Fig.1 The preparation process of amphiphilic HMHEC polymers

图2为HEC、HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ的FT-IR谱图。与HEC的FT-IR谱图相比，HMHEC 聚合物在1 210～1 000、2 929、1 360和1 463 cm-1附近的吸收峰强度增加。1 210～1 000 cm-1处的吸收峰为C—O伸缩振动吸收峰和C—O—C不对称伸缩振动吸收峰，表明HMHEC 聚合物结构中醚键含量增加；2 929 cm-1处为C—H伸缩振动吸收峰，峰强增加说明聚合物中烷烃结构增加；1 360和1 463 cm-1处分别为甲基和亚甲基的对称弯曲振动峰和不对称弯曲振动峰。结果说明BD-12和BD-18的长碳链已成功接枝到HEC主链上。

表1 HMHEC的合成、性能及其自组装纳米胶束的特性参数Tab.1 Preparation, properties of HMHEC polymers and characterization of their self-assembled micelles

图2 HEC与HMHEC的FT-IR谱图Fig.2 FT-IR spectra of HEC and HMHEC polymers

图3为HEC和HMHEC聚合物的1H-NMR 光谱图。从图中可以看出，HEC糖环上各个氢原子信号峰的化学位移在3.19～4.48，其中4.48处为糖环C1氢原子的信号峰，3.88处为C6氢原子的信号峰，3.58～3.69处为C3～C5氢原子的信号峰，3.31和3.17处为C4氢原子的信号峰，1.88处为羟乙基中亚甲基(C7～C8)上氢原子的信号峰。HMHEC聚合物上各个氢原子的信号峰位于0.85～1.97，归属如下：0.85 处为长链烷基中—CH3的氢原子信号峰；1.97、1.21和0.97处均为长链烷基中—CH2—氢原子的信号峰。

图4为HEC和HMHEC聚合物的热重图。HEC的初始降解温度为165.9 ℃，HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ的初始降解温度分别为141.2和96.7 ℃。HEC的最大热降解温度为230.8 ℃，HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ的最大热降解温度较低，分别为192.8和197.6 ℃。HEC经疏水化改性后热稳定性能下降。

图3 HEC与HMHEC的1H-NMR光谱图Fig.3 The typical 1H-NMR of HEC and HMHEC polymers

2.2 HMHEC纳米胶束的表征

图5为HMHEC聚合物的CMC值的测试曲线。从图中可以看出，HMHEC-Ⅲ和HMHEC-Ⅸ聚合物的CMC值分别为378和282 μg/mL。说明随着聚合物中碳链链段的增加，HMHEC聚合物的疏水能力增强，聚合物形成的纳米胶束溶液更加稳定，CMC值降低。

(a) TGA

(b) DTGA

图5 I1/I3随HMHEC共聚物在水中浓度的变化曲线Fig.5 Plots of the I1/I3 ratio of pyrene emission spectra in water as a function of the log concentration of HMHEC polymers

图6为两亲性HMHEC-Ⅲ聚合物纳米胶束的粒径分布图和TEM图。从图中可以看出，HMHEC-Ⅲ聚合物在水溶液中自组装形成均一的纳米胶束，其粒径在50 nm左右。聚合物胶束的粒径和Zeta电位如表1所示，对于以BD-12作为疏水链段得到的HMHEC，随着聚合物中疏水单体由40%增加至200%，聚合物胶束的平均粒径由250 nm减小到82 nm，说明聚合物中疏水单体含量增加，疏水作用力增强，聚合物形成的胶束结构更加紧密，粒径减小。以BD-18作为疏水链段得到的HMHEC也呈现相同趋势。在疏水单体用量相同时，增加疏水链段的链长将会降低胶束的平均粒径，说明疏水链段的长度增加将会增强聚合物之间的疏水作用力，使得聚合物的自组装能力提高。

(a) DLS

(b) TEM

2.3 两亲性疏水改性衍生物HMHEC纳米胶束对吴茱萸碱的包载

由表2可以看出，HMHEC聚合物胶束在包载药物前粒径为83～250 nm，包载PTX后粒径为157～343 nm，包载EVO后粒径为134～312 nm，包载药物后聚合物胶束粒径增大。以BD-12作为疏水链段得到的HMHEC，随着疏水单体用量由40%增大至200%，其自组装纳米胶束对PTX的包封率由53.2%增大至79.5%，对EVO的包封率由54.4%增大至85.8%。说明聚合物中疏水单体用量增加，聚合物的疏水能力增强。以BD-18作为疏水链段得到的HMHEC也呈现相同趋势。说明相同疏水单体用量的条件下，增加碳链长度有利于提高聚合物的疏水能力，进而提高其药物包载能力。

3 结 论

在NaOH/异丙醇体系中，借助HEC分子链上的羟基与溴代烷烃之间的醚化反应，通过改变溴代烷烃用量、溴代烷烃链长，制备了一系列具备不同疏水链段含量和疏水链段链长的HMHEC聚合物。FT-IR和1H-NMR 结果表明长碳链结构成功引入到HEC分子链中。TGA结果表明经改性后HEC的热稳定性能下降。HMHEC在水溶液中可自组装形成以疏水碳链为核、亲水HEC为壳的球形胶束。HMHEC在水溶液中可自组装形成以疏水碳链为核、亲水HEC为壳的球形胶束。胶束平均粒径为83～250 nm，粒径大小随疏水链段含量和链长的增加而降低。HMHEC-Ⅲ 和HMHEC-Ⅸ聚合物的CMC值分别为282和378 μg/mL。HMHEC聚合物自组装纳米胶束对PTX和EVO的最大包封率分别为79.5%和96.3%。胶束包载药物后，粒径增大。

表2 HMHEC纳米胶束对抗癌药物的包封率Tab.2 Encapsulation efficiency of HMHEC nano-micelles