氢化豆油摄入对小鼠小肠反式脂肪酸含量及IL-8表达的影响

梁 帅， 王 晗， 陈 珺， 简 路 洋，郭 琦， 肖 珊， 刘 冰 南， 王 际 辉

( 1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

反式脂肪酸(TFA)是一类含有反式构型双键的脂肪酸[1]。食物中反式脂肪酸的来源主要有4种：(1)反刍动物瘤胃中微生物的转化；(2)植物油的氢化；(3)多不饱和脂肪酸含量高的植物油或鱼油精炼脱臭工艺；(4)烹饪时油温过高[2]。食物中反式脂肪酸的主要形式是反油酸(9t-18：1)、反亚油酸(9t，12t-18：2)以及反异油酸(11t-18：1)。

油脂的氢化是反式脂肪酸的主要来源，氢化豆油常在巧克力、冰激凌、糕点等食品中使用，是人们日常饮食摄入反式脂肪酸的主要途径之一。研究发现，反式脂肪酸会增加人体血液中的低密度脂蛋白含量，增加动脉硬化的风险[4]。在对心脏病患者和健康人的体脂中发现，心脏病患者体内的反式脂肪酸的含量明显高于健康人[5]。有研究证据显示，反式脂肪酸具有较强的全身致炎作用[6]，同时TFA会抑制甘油三酯的合成，干扰正常脂肪酸的代谢，因此会对发育产生影响[7]。白细胞介素-8(IL-8)是一种能激活嗜中性粒细胞的趋化性细胞因子[8]。主要由内皮细胞、上皮细胞及T淋巴细胞在TNF-α和外源性因子的刺激下产生[9]。IL-8对肠道免疫屏障功能具有重要作用[10]。目前，加工产生的反式脂肪酸对肠道健康的影响尚不清楚。本实验研究了饲料中添加氢化豆油对小鼠小肠脂肪酸组成以及IL-8表达量的影响，以期为反式脂肪酸影响肠道功能的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BF3-CH3OH溶液，美国Sigma；反油酸甲酯、反异油酸甲酯、反亚油酸甲酯、共轭亚油酸甲酯标准品，美国Sigma；AIN-93饲料，江苏南通特洛菲饲料科技有限公司；全蛋白提取试剂盒，上海生工生物工程有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；抗IL-8单克隆抗体预包被酶标板，北京博奥森生物技术有限公司；气相色谱仪，安捷伦科技有限公司；酶标仪，Thermo Multiskan GO。

1.2 脂肪酸组成检测

将食用油用氯仿-甲醇溶液萃取，脂肪酸提取物在碱性条件下进行皂化，再加入14%的BF3-CH3OH 溶液甲酯化。使用GC-MS气相色谱测定脂肪酸甲酯的组成。GC-MS检测条件：进样口温度250 ℃；程序升温：120 ℃，3 min；8 ℃/min升温至175 ℃维持28 min；3 ℃/min升温至220 ℃ 维持28 min[11-12]。使用反油酸甲酯、反异油酸甲酯、反亚油酸甲酯、共轭亚油酸甲酯等标准品，采用峰面积归一化法对实验结果进行分析。

1.3 小鼠实验

1.3.1 实验动物

选用大连医科大学SPF实验动物中心的纯系小鼠进行实验。均为3周龄断乳鼠，随机分为压榨大豆油组(对照组)和氢化豆油组，每组4只。

1.3.2 饲料制备

将AIN-93饲料与实验油脂混合搅拌机搅拌均匀制成块状饲料，-20 ℃保存[13]。饲料配比见表1。

表1 小鼠饲料组成Tab.1 The component of mouse feed %

1.3.3 实验设计

设压榨大豆油组(对照组)和氢化豆油组(实验组)。每组小鼠(3周龄)称重并测量尾长，在18～22 ℃动物室内饲养，喂食普通饲料，保证饮用水供给适应环境3 d。

各组小鼠每天分别投放对应实验饲料，自由采食，保证饮用水供给，每2 d更换一次垫料，保持饲养温度18～22 ℃，饲养至8周龄(成年)。

1.3.4 小鼠生长指标监测

每只小鼠每7 d测量体重和尾长，至8周龄。

1.3.5 样品采集

各组小鼠饲养至8周龄进行样品采集。实验前断食12 h，清理笼中残留饲料，以减少肠道中残留食糜对实验结果的干扰。

小鼠用颈椎脱臼法处死并解剖。取小鼠小肠(回肠)组织，用生理盐水冲去肠道内食糜等，分装于冻存管中，样品液氮速冻后置-80 ℃冰箱中保存待用[14]。

1.4 小鼠小肠脂肪酸组成检测

将小鼠小肠组织剪碎，加入氯仿-甲醇溶液破碎并萃取，脂肪酸提取物在碱性条件下进行皂化再加入14% BF3-CH3OH溶液甲酯化。使用气相色谱测定脂肪酸甲酯的含量，GC-MS检测条件同“1.1”。采用峰面积归一化法对实验结果进行分析。

1.5 小鼠小肠IL-8含量检测

1.5.1 小鼠小肠组织蛋白提取

将100 mg组织剪碎，用PBS缓冲液洗涤两次，3 500 r/min、4 ℃离心10 min。取沉淀后加入0.5 mL含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的Lysis buffer，4 ℃匀浆裂解组织。13 000 r/min、4 ℃ 离心10 min取上清液，分装至预冷离心管中，即为全蛋白提取物，-80℃保存待用。

1.5.2 小鼠小肠组织蛋白浓度检测

BCA法是目前常用蛋白浓度检测方法之一。实验使用现配制的BCA液与稀释后的蛋白提取液37 ℃孵育30 min，用酶标仪在562 nm波长下比色，根据所测样品的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白含量，计算样品蛋白浓度。

1.5.3 小鼠小肠组织IL-8含量检测

采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)测定小鼠小肠组织IL-8含量。提取的小鼠小肠组织蛋白提取液适当稀释后加入抗IL-8单克隆抗体预包被酶标板，定容至20 μL，37 ℃温育后洗去未结合的成分。加入HRP标记的IL-8抗体，37 ℃温育后洗去未结合的成分。加入显色剂显色，在450 nm测定样品吸光度，630 nm测定空白孔吸光度。计算后通过绘制的标准曲线计算样品中IL-8含量。

1.6 数据分析

采用Student’st-test进行显著性分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义，以P<0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 实验食用油的脂肪酸组成

使用压榨大豆油与氢化豆油作为压榨大豆油组(对照组)和氢化豆油组实验用油，两种食用油的脂肪酸成分GC-MS检测结果如表2所示。氢化豆油中反-十八碳一烯酸的质量分数为19.48%，显著高于压榨大豆油；反亚油酸的质量分数为0.26%，高于对照组，但含量较少。两组小鼠饲料油脂中压榨大豆油添加量分别为100%和80%，计算得氢化豆油组中亚油酸(n-6)与α-亚麻酸(n-3) 质量比为5∶1，满足小鼠正常生长所需。

2.2 小鼠小肠反式脂肪酸组成

实验小鼠饲养至8周龄，取小肠组织，提取脂肪酸经GS-MS检测比较有代表性的反式脂肪酸和共轭亚油酸检测结果见图1。

表2 实验食用油的脂肪酸组成Tab.2 Fatty acid compositions of edible oil for the experiment %

如图1(a)所示，经实验组和对照组饲料饲养35 d后，氢化豆油组小鼠小肠反-十八碳一烯酸的质量分数为2.79%，显著高于压榨大豆油组的0.12%(P<0.01)。氢化豆油组饲料油脂中的反-十八碳一烯酸质量分数为3.90%，与小肠组织中的含量接近，表明小肠组织中的反式脂肪酸主要来源于饮食。

如图1(b)所示，氢化豆油组小鼠小肠反油酸(t9-18：1)的质量分数为0.95%，显著高于对照组的0.11%(P<0.01)；氢化豆油组小鼠小肠反异油酸(t11-18：1)质量分数为0.61%，对照组未检出反异油酸成分。反油酸和反异油酸是氢化豆油组小鼠小肠反-十八碳一烯酸的主要成分，分别占反-十八碳一烯酸的34.10%及21.83%。

如图1(c)所示，氢化豆油组小鼠小肠共轭亚油酸(CLA)的质量分数为0.32%，显著高于对照组0.08%(P<0.01)。有研究表明，反异油酸可以在小鼠体内转化为c9，t11-18：2共轭亚油酸[15]，因此推测氢化豆油组共轭油酸可能来源于饲料油脂和体内转化。

(a) 反-十八碳一烯酸

2.3 小鼠生长指标

饮食会对小鼠的生长发育产生影响，体重和尾长是评价小鼠生长情况的常用指标。因此实验对小鼠生长过程3～8周龄中的体重和尾长进行了测量，结果见图2。

如图2(a)所示，氢化豆油组小鼠食用含有氢化豆油的饲料5周后，体重增长率为331.52%，压榨大豆油组298.75%，两组的体重增长率差异显著(P<0.05)。结果表明，氢化豆油的摄入对小鼠有明显的增重作用，因此推断氢化豆油摄入所致小鼠体重增加可能与氢化豆油中反式脂肪酸含量较高有关。

如图2(b)所示，压榨大豆油组和氢化豆油组小鼠尾长增长率分别为128.68%和134.41%，并无显著差异(P>0.05)。表明反式脂肪酸对小鼠尾长无明显影响。

(a) 体重

(b) 尾长

氢化豆油组小鼠的体重增长更快，而尾长增长率无显著差异。因此氢化豆油的摄入可能并未促进小鼠的生长，而只是增加了小鼠的体重。研究表明，反式脂肪酸升高血液中胆固醇含量，增大心血管疾病和胰岛素抗性甚至糖尿病的发病几率，导致肥胖。由此推测氢化豆油组小鼠的体重较对照组的差异可能与反式脂肪酸促进肥胖的影响有关。

2.4 小鼠小肠组织IL-8含量

ELISA法检测小鼠小肠组织IL-8的含量如图3所示。氢化豆油组小鼠小肠IL-8质量分数为16.91 pg/g，低于压榨大豆油组的23.51 pg/g(P<0.05)。结果显示，氢化豆油摄入增加了小鼠小肠总反-十八碳一烯酸的质量分数(2.79%)，显著高于压榨大豆油组(0.12%)。现有的研究表明，IL-8在肠道免疫功能中发挥了重要作用。研究发现，伴随着反-十八碳一烯酸含量的增加，氢化豆油组小鼠肠道IL-8显著降低，提示氢化豆油的摄入引起肠道反式脂肪酸增加可能干扰小鼠肠道免疫功能。同时发现，氢化豆油组小鼠小肠CLA质量分数增加(0.32%)，是压榨豆油组的4倍。有研究表明，虽然CLA可能对机体的免疫状态有一定的调节作用，对促进免疫平衡具有有益的影响，但是氢化豆油组小肠反-十八碳一烯酸含量显著增高，约是压榨豆油组的23倍；而且在氢化豆油组，反-十八碳一烯酸的含量显著高于CLA含量，约为CLA的9倍。因此，在氢化豆油摄入影响小鼠IL-8表达的作用中，综合反式脂肪酸和CLA的影响，表明反式脂肪酸可能发挥了主导作用。

图3 小鼠小肠IL-8的质量分数Fig.3 Content of IL-8 in small intestine of mice

3 结 论

本实验研究了氢化豆油摄入对小鼠肠道脂肪酸组成及IL-8表达的影响，发现氢化豆油组小鼠小肠组织中反-十八碳一烯酸质量分数为2.79%，显著高于对照组0.12%。氢化豆油组小鼠小肠组织的IL-8质量分数为16.91 pg/g，显著低于对照组23.51 pg/g。氢化豆油组小鼠小肠IL-8表达的降低可能与氢化豆油中反式脂肪酸的摄入所致的小肠反式脂肪酸增加有关，其相关作用机制有待进一步的研究。