酵母菌和乳酸菌发酵葡萄皮渣生物饲料的研究

翟羽佳，张惠玲，张丽芝

（1.宁夏大学，宁夏 银川 750021；2.银川能源学院，宁夏 银川 750105）

随着葡萄酒酿造行业的不断发展，其废弃物——葡萄皮渣的产生量也日益增加。葡萄皮渣主要是葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗等，是葡萄加工过程或葡萄酒生产过程产生的下脚料，营养价值丰富，并且集中于葡萄加工过程或葡萄酒生产过程，易于收集，因此，葡萄渣在饲料上的利用优势明显[1]。

近年来，有较多关于葡萄皮渣综合利用的研究报道，但主要集中于其有效成分提取工艺和生物活性方面的研究[2-3]，以及单纯利用酵母菌发酵葡萄皮渣生产饲料的研究[4-5]。有学者使用香菇—酵母共生系统发酵冰葡渣饲料[6]，而对酵母菌和乳酸菌组合发酵葡萄皮渣生产饲料则鲜有报道。研究表明，乳酸菌和酵母菌之间稳定的共培养是普遍存在的，因为该种共生作用可以增加微生物对于复杂食品系统的适应性[7]，同时也能增加菌种之间的协作。利用酵母菌和乳酸菌混合发酵可以增加发酵产物的适口性，同时能发挥乳酸菌的益生作用和抑菌功能[8]。葡萄皮渣作为一种廉价且来源丰富的资源，用来生产单细胞蛋白生物饲料具有很大的开发潜力。该研究以产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌混合发酵葡萄皮渣生产生物饲料，根据发酵后产物的真蛋白含量变化情况，探讨2种菌的共生关系，同时对葡萄皮渣固体培养基配方和发酵条件进行优化，以期获得品质优良的发酵葡萄皮渣生物饲料，为拓宽饲料原料资源提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种：产朊假丝酵母菌（Candida tails）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）培养物，由山东落星生物工作室提供，均为斜面培养后2次活化得到的菌液。

1.1.2 原料与试剂：葡萄皮渣，由宁夏张裕摩塞尔15世酒庄有限公司提供；麸皮、玉米，市售；尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等均为分析纯。

1.1.3 葡萄皮渣固体培养基：葡萄皮渣75%，辅料（玉米∶麸皮=1∶1）25%，尿素 1.5%，硫酸铵 1.0%，磷酸二氢钾1.0%，硫酸镁 0.30%，料水比 1.0∶1.0，自然条件下pH值，称取100 g置于500 mL三角瓶中。

1.1.4 主要仪器设备：高速万能粉碎机，鼓风干燥箱，电子天平，隔水式恒温培养箱，控温消煮炉，凯氏定氮装置。

1.2 试验方法

1.2.1 葡萄皮渣发酵工艺：原辅料→混合→加水润料→接种→混合→发酵→干燥→粉碎→发酵产品。

1.2.2 操作要点：①原辅料处理。葡萄皮渣经50℃烘干24 h，粉碎，过40目筛；麸皮、玉米，粉碎过40目筛。②原料混合。尿素及无机盐先溶于一定量的蒸馏水中，再与原辅料混合均匀，混合后的物料呈松散不结团状态。③接种。将活化的产朊假丝酵母菌菌液和嗜酸乳杆菌菌液按比例接入固体培养基。④发酵：取500 mL三角瓶，每瓶分装100 g固体培养基，32℃恒温培养箱内发酵72 h，每日翻动2次。⑤干燥：在恒温鼓风干燥箱中50℃烘干至恒重。⑥粉碎。将干燥样用粉碎机粉碎后过40目筛。

1.2.3 发酵菌种比例确定试验

1.2.3.1 菌种间不同接种比例发酵试验：为确定产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌之间的合适配比，在葡萄皮渣固体培养基中按10%的接种量接入不同比例的混合菌种，设置的产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌的配比分别为：A（2.0∶1.0）、B（1.5∶1.0）、C（1.0∶1.0）、D（1.0∶1.5）、E（1.0∶2.0）、F（空白对照组，发酵前），每个配比3次平行，自然条件下pH值，32℃恒温培养72 h，低温烘干至恒重，粉碎后测定其真蛋白含量。

1.2.3.2 不同接种量发酵试验：2种菌按照5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的不同接种量接种到葡萄皮渣固体培养基中，每个接种量3次平行，自然条件下pH值，32℃恒温培养72 h，低温烘干至恒重，粉碎后测定其真蛋白含量。

1.2.4 固体培养基配方的优化：将尿素、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁4个影响因素进行4因素4水平L1645正交试验，测定产物真蛋白含量，确定最佳培养基配方。

1.2.5 发酵条件的优化：将培养基投放质量、温度、时间、料水比4个因素进行4因素3水平L934正交试验，测定产物真蛋白含量，确定最优发酵条件。

1.2.6 发酵产物指标的检测：样品中的水分、粗灰分、粗蛋白、钙、总磷、粗脂肪、粗纤维按照国标方法进行测定。总糖的测定方法：精确称取原料试样，经过盐酸水解、氢氧化钠中和后定容，离心，采用DNS法[9]测定。真蛋白含量的测定：采用硫酸铜沉淀法[10]。

1.2.7 葡萄皮渣固体培养基营养成分分析：葡萄皮渣由于加工方式的不同，其营养成分也会有所差别。为满足微生物生长需要，培养基中必须兼顾碳源、氮源、无机盐、能量、生长因子和水分等营养要素。该试验所用的葡萄皮渣来自红提酿酒后的下脚料，为便于开展试验，按1.2.2项下方法处理后，测定其营养成分含量。

2 结果与分析

2.1 葡萄皮渣固体培养基营养成分分析

由表1可知，葡萄皮渣含有较丰富的营养物质，但糖含量偏低，蛋白含量较少，需采用其他辅料补充其不足部分。玉米和麸皮含糖量较高，是理想的碳源，同时麸皮具有多孔性结构利于发酵过程中的通气。尿素和硫酸铵是常用的廉价氮源，不仅可以提高单细胞蛋白含量,同时可以促进菌体生长，在微生物发酵中总是将二者混合使用，其效果要优于单一使用[11]。磷酸二氢钾和硫酸镁作为能量来源和生长因子，对提高蛋白转化有一定促进作用，从而构成营养全面的固体培养基，保证微生物的良好生长。

2.2 发酵菌种比例确定试验

2.2.1 菌种间不同接种比例对发酵产物真蛋白含量的影响：由图1可知，当产朊假丝酵母菌与嗜酸乳杆菌比例为1.5∶1.0（B）时，产物的真蛋白含量最高（14.28%），当配比为 2.0∶1.0（A）时，产物的真蛋白含量也较高（14.09%）。这2组发酵产物的表面被一层白色菌丝所覆盖，菌丝体成块，且具有浓郁的酸香气味。

表1 葡萄皮渣及辅料的主要营养成分含量%

从试验结果可以看出，当产朊假丝酵母菌的添加比例较高时，发酵产物的真蛋白含量较高，由此可知，产朊假丝酵母菌对发酵产物的真蛋白含量影响较大，而嗜酸乳杆菌的影响较小。这主要是由于产朊假丝酵母菌在发酵过程中可以利用底物的营养成分在短时间内合成菌体蛋白[12]，而乳酸菌在发酵中也是必不可少的，因为它在发酵中起到产酸的作用，可以抑制杂菌的生长，同时，产生的乳酸可以改善发酵饲料的适口性[13]。因此，确定产朊假丝酵母菌与嗜酸乳杆菌之间的最佳比例为 1.5∶1.0。

图1 复合菌间不同接种比例对发酵产物真蛋白含量的影响

2.2.2 复合菌不同接种量对发酵产物真蛋白含量的影响：由图2可知，随着复合菌接种量的增加，发酵产物的真蛋白含量也随之增加，当接种量为10.0%～12.5%时，发酵产物的真蛋白含量最高，但相差不大，当接种量为15.0%时，真蛋白含量小幅降低，这可能是由于接种量过大，菌种生长较快，营养物质消耗过快，会释放大量热量，容易导致温度过高，从而抑制菌体生长[13]；而接种量过小，发酵周期较长，发酵过程也容易污染杂菌。综合以上因素以及试验经济成本，确定最佳接种量为10.0%。

2.3 固体培养基优化正交试验

图2 复合菌不同接种量对发酵产物真蛋白含量的影响

按照L1645正交试验方案设计试验，根据图1、图2的结果，因素水平如表2所示，16组试验组合中的真蛋白含量结果见表3，方差分析结果见表4。由表3、表4可知，因素A在α=0.05水平上显著，因素C和因素D在α=0.25水平上显著，因素B不显著。主次因素顺序为A＞D＞C＞B，最优水平组合为A2B3C4D3，即葡萄皮渣固体培养基中最佳添加量为：尿素1.5%，磷酸二氢钾1.5%，硫酸镁0.4%，硫酸铵1.5%。与文献研究相符，尿素、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾4个因素对微生物生长均具有显著作用[14-15]。

2.4 发酵条件优化正交试验

根据上述试验结果，按照L934正交试验方案设计试验，因素水平如表5所示，分别检测9组试验组合中的真蛋白含量，结果见表6。将表6中极差分析结果最次要的因素C作为空列，进行方差分析，结果见表7。影响微生物发酵的主要因素包括温度、发酵时间、料水比、通气条件等，产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌混合发酵属于好氧发酵，而发酵料的投放量直接影响发酵过程的通气状况，发酵料投放太多，通气状况不佳，不利于微生物的生长，发酵料投放太少、太薄，造成资源浪费又不可行。由表6、表7可知，培养基的投放量对发酵产物真蛋白含量影响最大，在α=0.05水平上显著，其次是发酵时间和料水比，主次因素顺序为A＞B＞D＞C，最优水平组合为 A1B2C3D2，因发酵温度影响不大，考虑到试验成本，因素C选择C2，最佳发酵条件为正交表中A1B2C2D2组合，即：培养基投放量 100 g/500 mL，料水比 1.0∶1.0，32 ℃发酵 72 h。

表2 培养基配方L1645正交试验的因素和水平 %

表3 培养基配方L1645正交试验方案及结果

表4 培养基优化正交试验方差分析结果

表5 发酵工艺正交试验L934的因素和水平

pH值是影响微生物生长代谢的关键因素之一，但固态发酵中某些物料的优良缓冲性能有助于减少对发酵体系pH值控制的需要，所以固态发酵时，只要把初始pH值调到所需要的值，发酵过程通常不用检测和控制pH值[16]。

2.5 发酵前后葡萄皮渣真蛋白含量变化

由表8可知，利用产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌固态发酵葡萄皮渣，产物真蛋白含量变化明显，发酵后产物的真蛋白含量较发酵前提高了4.35%，但发酵前后粗蛋白含量变化不大，这是因为一部分无机氮在发酵过程中转化为菌体蛋白或含氮代谢产物类优质蛋白，提高了发酵产物的蛋白品质，产物呈白色团状，具有浓郁的酸香气味，这可能是酵母菌与乳酸菌共生产生的风味物质[17-18]。

表6 发酵工艺L934正交试验方案及结果

表7 发酵工艺优化正交试验方差分析结果

3 讨论

该研究利用产朊假丝酵母菌和嗜酸乳杆菌混合固态发酵葡萄皮渣生产生物饲料，确定了2种菌的接种比例为1.5∶1.0，接种量为10.0%，发酵产物的真蛋白含量较高，富含菌体蛋白，菌体成块，气味酸香。

只有营养全面、配比合适的发酵培养基，才能够促进微生物的生长、繁殖。该研究使用的培养基基础成分为：葡萄皮渣75%，辅料25%（玉米∶麸皮＝1∶1），通过正交试验进一步确定了尿素及无机盐最佳添加量为：尿素1.5%，硫酸铵1.5%，硫酸镁0.4%，磷酸二氢钾1.5%。最佳发酵条件为：发酵料投放量100 g/500 mL，料水比 1.0∶1.0，自然条件下pH值，32℃发酵72 h后，产物粗蛋白含量为21.48%，真蛋白含量为14.45%，发酵后产物的真蛋白含量较发酵前提高了4.35%，表明葡萄皮渣的饲用价值提高，此外，发酵后的葡萄皮渣具有酸香气味，提高了其适口性。

表8 发酵前后葡萄皮渣粗蛋白和真蛋白含量

利用微生物间协作特性处理葡萄皮废渣生产生物饲料，在提高蛋白质含量的同时，产物中含有大量活性和非活性有益微生物，该方法投资小、见效快，可把发酵物包括菌体及其代谢产物和底物全部利用，既保留了活性成分又没有废液污染的问题；此外，发酵前基质不用灭菌，因葡萄皮渣培养基自然显酸性，可抑制一部分杂菌的生长，只要接入的发酵菌种达到一定比例，就会抑制其他杂菌的污染，能够保证发酵质量，从而减少了设备投资，节约了能耗。

根据发酵产物的营养特性，发酵葡萄渣可以作为反刍动物的饲料，同时也属于生物活性饲料。研究表明，日粮中添加益生菌可以调节反刍动物瘤胃pH值，从而促进反刍动物对营养物质的消化吸收，提高采食量。此外，益生菌的繁殖又反过来可以抑制病原微生物的繁殖，从而对动物机体起到增强免疫力和抗病力的作用[19]。