猪流行性腹泻诊断方法研究进展

王 婧 ，刁小龙 ，牛蒙蒙 ，陈晓兰 ，张 龙

（1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2.中崇信诺生物科技泰州有限公司，江苏 泰州 225300）

1 猪流行性腹泻

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）主要引起断奶仔猪出现呕吐、腹泻和脱水等症状，与传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）同属于冠状病毒，二者均可引起猪肠道性传染病[1]。PEDV可感染多个年龄段的猪，尤其对仔猪的传染性较普遍。仔猪感染PEDV后死亡率较高，1周龄的仔猪可在发生腹泻后的4～5 d出现严重脱水从而导致死亡，死亡率高达50%，最高可达到100%。该病的主要传播途径是经消化道传播，病猪是主要的传染源。PEDV随粪便排出，传染速度较慢，通常在4～5周内传染整个猪场。由于该病的发病率较高，每年都会导致养猪行业的巨大损失。

图1 病猪肠壁薄，肠内部出现黄色水样稀粪和黄色乳凝块[3]

1.1 流行病学特点

猪流行性腹泻的发生有明显的季节性，通常于冬季12月至第2年的2月发病，有时夏季也会发病。该病易感染各种日龄的猪，哺乳期、断奶期和育肥期猪感染率达15%～90%，仔猪的死亡率在50%，日龄越小被感染的概率越大。断奶猪、育肥猪感染该病后症状比较轻，成年猪则主要表现为呕吐和厌食等症状[2]。自20世纪80年代国内首次报道发现流行性腹泻病毒至今，该病毒的感染率在我国呈现逐年升高的态势，虽然在一定程度上疫苗起到了一定的保护作用，但是在2010年之后，该病在我国有了死灰复燃的趋势。

1.2 病理变化

感染PEDV的病猪发病前期腹泻主要排黄色黏稠便，后期为水样便并伴有精神不振[1]。病猪小肠扩张，肠内容物为黄色液体（见图1）或呈泡沫状，肠壁变薄（见图2）、变透明。小肠绒毛显著缩短。部分病猪胃呈空虚状态，或者充满黄色液体。

2 病原检测技术

2.1 病毒分离与鉴定

病毒分离鉴定技术是检测畜禽病毒的主要方法，也是最切实可行的方法[4]，收集病变猪空肠和肠内容物，用加有双抗的PBS（磷酸盐缓冲液）配成5倍悬液离心，将离心后的上清液用微孔滤膜过滤，依照一定的比例在单层Vero细胞上接种，放置于37℃的培养箱中培养 3～4 d，观察细胞病变[5]。 感染 PEDV 的Vero细胞最明显的病变特征是细胞融合，形成多核体，并最终凋亡脱落。另外，也可将PEDV接种鸭小肠上皮细胞系，在胰酶存在的情况下病毒能够迅速繁殖。

2.2 免疫电镜观察

图2 病猪肠壁变薄[3]

免疫电镜技术是在超微结构水平上用来研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法，是免疫化学技术与电镜技术结合的产物。PEDV和TGEV都可引起各种年龄猪腹泻，两者同为冠状病毒属且借助普通电镜无法区分。免疫电镜能够准确地诊断病原体，可用已知的PEDV抗原检测未知抗体。该方法也可用于区分PEDV和同属冠状病毒科的其他病毒[6]。将含有抗原和抗体的溶液或血清离心，将2种溶液等量混合，37℃培养30 min，然后转移到恒温箱，然后再次离心样品，对沉淀物进行染色，放在免疫电镜下观察，可以观察到由病毒粒子形成的免疫复合物。电镜观察结果表明两者在形态上存在有细微差异，即猪流行性腹泻病毒粒子大小变化不一，呈多形性，纤突短小而密集，核芯呈多形性；猪传染性胃肠炎病毒粒子大小较均一，呈圆形或呈椭圆形，纤突大而稀疏，核芯为环形[7]。

3 免疫学诊断技术

免疫学诊断技术是根据抗原、抗体可进行特异性结合的原理，应用已知的抗原检测未知的抗体或应用已知的抗体检测未知抗原。该技术特异性高，简便安全，能快速准确地诊断感染性疾病，有利于疾病的早期诊断。

3.1 血清中和试验

中和试验是在测定病毒感染力的基础上，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，用于判定免疫血清中和病毒的能力的一种方法，该方法具有检测结果准确、可靠，检测灵敏度高的优点。有学者以PK15（猪肾细胞）为指示细胞，采用适应Vero细胞的PEDV将醛化鞣酸化红细胞致敏，建立了PEDV微量中和试验，该方法特异性好，操作简便，可用于大规模的流行病学调查[5]。

3.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种成熟的实验室血清学检测方法，包含间接ELISA、双抗体夹心ELISA、竞争ELISA等，被定为国际贸易标准诊断方法之一[8]。ELISA 具备易于操作、价格低、灵敏度高、检测迅速等优势，ELISA既可以从病猪的粪便中检测出PEDV抗原，又可以从病猪的血清中检测出PEDV抗体[9]。ELISA法出现之前，许多国外科学家应用培养的病毒检测PEDV抗体。邓祖丽颖[10]等利用猪流行性腹泻病毒抗原重组蛋白包被96孔板建立了间接ELISA方法用于检测PEDV S蛋白抗体，并利用该方法对河南省不同地区猪场的母猪和育肥猪进行检测，阳性对照血清呈亮橙色，阴性对照血清孔无色或基本无色。结果表明来自河南不同地区23个猪场的279份血清中母猪阳性率为97.42%，育肥猪阳性率为71.74%。因为猪流行性腹泻病毒难以适应细胞培育，全病毒抗原制备的潜在危险，导致ELISA诊断技术仅限于实验室应用。

4 分子生物学检测技术

分子生物学检测技术是根据基因中的某一序列，检测出基因中所包含的抗体。可以弥补免疫技术的缺陷，缩短诊断时间，且该技术应用广泛，可用于各种病原微生物的检测。

4.1 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR技术具备重复性好、灵敏性高等优势，检测技术要优于其他的分子生物学检测技术，被世界动植物卫生组织（OIE）引荐用于动物疾病的检测[11]。该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，应用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后经过详细的数学原理对未知模板的定量剖析[12]。 刘邓等[13]根据 PEDV N 基因序列设计一对特异性引物和探针，建立了TaqMan荧光定量PCR方法，并检测了80份临床样本的PEDV病毒含量，阳性率为95%，而反转录PCR检测阳性率为85%，表明该措施灵敏性显著高于一般PCR，可以利用荧光定量技术对PEDV病毒进行检测。

4.2 反转录酶链式反应（Reverse Transcriptional PCR，RT-PCR）

RT-PCR方法简便、快速、灵敏、特异，是实验室中常用的分子生物学诊断方法之一。吴学敏等[14]建立了检测PEDV M基因的RT-PCR方法，该方法具备较好的特异性和灵敏性，能精准地检测到PEDV RNA 100 pg，可用于临床诊断猪流行性腹泻病毒。郭容利[15]等采用RT-PCR方法检测江苏、安徽、河北、山东等地的146头仔猪腹泻样品，82份样品为PEDV阳性。

4.3 多重PCR技术

多重PCR技术是一种特殊形式的PCR，分子生物学的多个领域研究应用到多重PCR，例如病原体鉴定、遗传性疾病诊断等[12]。临床不能确定病猪被何种病毒感染时，通常采用多重PCR方法，一次反应就可以鉴别样品中的TGEV和PEDV，甚至鉴别更多病原种类，结果较准确，从而达到诊断和治疗的作用。多重PCR和一般PCR比较，更加快速、方便，可短时间内提供结果。

4.4 胶体金免疫技术

胶体金免疫技术由于其灵敏性和特异性高的优势，无需特殊仪器，直接可以判断结果，适用于基层兽医部门。张利勃[16]等对金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）的胶体金进行标记作为指示介质，用重组表达的PEDV M蛋白抗原和抗金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）的基因抗体作为检测线和指控线，开发出用于检测PEDV血清抗体的胶体金免疫层析试纸条，进一步试验证明该试纸的灵敏度和ELISA几乎相同，符合率达96%。该试纸还具有灵敏度高、简洁快速等优点，为基层检测抗体提供便捷的措施。

5 其他检测技术

环介导等温扩增技术（LAMP）是利用体外核酸反应，在恒定的温度下，添加酶和特异性引物，得到迅速的核酸扩增技术，该方法设备简单、易于掌握、有效节省时间[17]。 郑新添[18]等将 PEDV 的 NP 基因，进行序列分析，成功设计了LAMP引物，优化反应体系，在65℃下扩增60 min，借助核酸染料染色后只需肉眼便可观察、判定结果。王伟[19]等根据PEDV的M基因建立了特异性强、灵敏度高的LAMP检测方法。罗亚坤[20]等基于PEDV的N基因设计6对引物，对建立环介导等温扩增检测方法进行了优化，成功建立了PEDV LAMP检测方法。

6 预防途径

猪场的环境卫生对预防病原感染具有重要的作用，因此保持猪场的环境卫生、保持地面整洁，定期清理排泄物、立即隔离患病猪[21]等措施对有效控制该病的传播具有重要意义。定期对猪场内部的通道、圈舍、相关用具进行清理和消毒，消毒时间应该安排在清理粪便之后，消毒次数为每天2次左右。同时还要经常对猪舍内的鼠、苍蝇、虫类进行消灭处理。对新引进的猪进行隔离观察，一旦疫情发生，及时焚烧和掩埋死亡的猪，最大限度将疫情控制在最小范围。

7 结语

腹泻类疾病是影响猪只健康的一类重要疾病，尤其是危害仔猪健康，而引起仔猪腹泻的病因复杂，包括饲养管理、断奶应激、病原感染等，其中PEDV是引起仔猪腹泻的病毒性疾病最重要的病原之一。该病传播迅速，在我国猪场中广泛存在，一旦发病较难控制，给养猪业造成严重的经济损失，增加养殖成本，同时若通过投放大量的药物进行预防或治疗，由于药物残留问题给食品安全带来隐患[22]。猪群发病时可以采取药物治疗和饥饿疗法相结合的方法进行治疗，对于一些严重的仔猪可以考虑静脉注射和腹腔注射给药[23]。随着生物科技的不断进步，对于该类疾病的诊断技术日趋完善，只有尽早对该病进行确诊才能及时采取相应的治疗手段，最大限度减少养殖户的经济损失。