蒙药小白蒿总黄酮物质提取工艺的优化

裴 乐 ，李 锋 ，刘秀丽 ，乔健敏 ，范金林 ，侯勇跃

（1.内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；2.呼和浩特市赛罕区农牧业局，内蒙古 呼和浩特 010020）

小白蒿，又名冷蒿，蒙药名称译为“阿给”，属菊科蒿属，其味苦、钝、涩、燥[1]，性凉，为多年生植物，多见于草原荒漠地带，在牧区既被当作母畜的营养饲料，又被用作预防各种疾病的蒙药汤剂，有止血、消肿、消“奇哈”的功效[2]。 据《晶珠本草》[3]记载，其有止血、祛风、消肿的功效，主治各种出血、关节肿胀、肾热、月经不调、疮痈，有些地区将其作为茵陈的替代品使用。

小白蒿中的有效成分主要包括黄酮类物质、倍半萜类物质、苯丙素类物质以及对甲基苯酚、4-羟基苯乙酮、β-谷甾醇、胡萝卜苷和苯甲酸等其他物质，其中，黄酮类物质主要为麦黄酮、木犀草素、棕矢车菊素、藿香苷、泽兰黄素、蓟黄素、田蓟苷、槲皮素、山柰酚、芦丁等[4-11]。大量研究表明，小白蒿中的黄酮类物质具有不同程度的清除自由基能力，且清除率优于VC，其体外抗氧化活性较强[12]。同时，其在抗菌、抗炎及抗肿瘤等方面也有比较突出的表现。小白蒿在多个方面影响白细胞的功能，能够增强机体免疫力，从而达到抗炎免疫、抗肿瘤的效果[13-14]。此外，小白蒿还具有止血和抗寄生虫等作用[15-16]。该研究以蒙药小白蒿为主要研究对象，对其黄酮类药效物质的提取工艺进行了研究，通过单因素试验分别考查溶剂种类及其浓度、小白蒿与溶剂的料液比、提取温度和提取时间等影响小白蒿总黄酮提取效果的因素，以期为今后更好地开发利用小白蒿提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 蒙药与试剂

小白蒿：将蒙药小白蒿粉碎后，过筛，将大量的棉絮状物质弃去，留下粉末，置于广口瓶中避光保存。

试剂：芦丁标准品（纯度≥98%，贵州迪大生物科技有限公司，批号：GZDD-0001）；无水乙醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；Al（NO3）3·9H2O（分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司）；NaNO2（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；NaOH（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。使用蒸馏水将Al （NO3）3·9H2O、Na NO2、NaOH 分别配制成 10%Al（NO3）3溶液、5%NaNO2溶液、4%NaOH 溶液。

1.2 仪器与设备

FA200413电子天平（上海佑科舜仪器仪表有限公司）；UV1000单光束紫外/可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；Super Mini Dancer调速型迷你离心机[（生工生物工程（上海）股份有限公司]；金怡HH-8数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；Lab ServTMLS-O610强制对流型烘箱（赛默飞世尔科技）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制：将芦丁标准品置于40℃恒温箱中，烘干至重量不变，准确称取24 mg，用20 mL 60%乙醇溶液溶解，配制成1.2 mg/mL的芦丁标准品溶液。将芦丁标准品溶液稀释，配制浓度 依 次 为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mg/mL。每个试管中分别吸取芦丁系列标准溶液1 mL，空白对照组为60%的乙醇溶液，也同样吸取1.0 mL加入试管中备用。向空白对照液和芦丁系列标准溶液中分别加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，静置6 min，当溶液颜色变为浅黄色时，再分别加入 10%Al（NO3）3溶液 0.3 mL，静置 6 min后，当溶液颜色逐渐变深且呈姜黄色时，分别加入4%NaOH溶液4.0 mL，此时颜色应变为石榴红色，静置15 min后，每个试管中分别加入60%的冰乙醇溶液4.4 mL定容，即每只试管溶液的总体积为10 mL，最后于相应波长进行吸光度值（OD值）的测定，重复3次取平均值。

1.3.2 最大检测波长的确定：使用浓度为0.1mg/mL的芦丁标准品溶液进行上述试验，在450～600 nm波长范围内进行全波长扫描测定OD值，重复3次，选择相对稳定的最大OD测定值，确定最大检测波长。

1.3.3 小白蒿总黄酮的提取：称取干燥的小白蒿粉末置于烧瓶中提取回流，分别考查提取所用的溶剂种类及其浓度、小白蒿与溶剂的料液比、提取温度和提取时间等影响小白蒿总黄酮提取效果的因素。试验重复3次，将混合液合并后真空抽滤即得到小白蒿的总黄酮提取混合液。

1.3.3.1 提取溶剂及其浓度的选择：根据前期抑菌预试验及相关参考文献[12，17-18]，选择石油醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、蒸馏水、超纯水等溶剂对100 mg的小白蒿粉末进行回流提取，吸取待测溶液0.1 mL，加入相应溶剂0.9 mL，对待测提取液进行稀释，即待测液稀释10倍后分别加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，静置6 min后，再分别加入10%的 Al（NO3）3溶液 0.3 mL，静置 6 min 后，再分别加入4%的NaOH溶液4.0 mL，静置15 min后，每个试管中分别加入60%的冰乙醇溶液4.4 mL定容至10 mL，最后于相应波长进行OD值的测定，重复3次取平均值。同时进一步使用50%、60%、70%、80%、90%、100%的溶剂浸泡小白蒿后，进行上述试验，测定其OD值，代入线性回归方程，分别得到不同浓度溶剂下的小白蒿总黄酮浓度，比较小白蒿总黄酮浓度，进而选择溶剂并确定其浓度。

1.3.3.2 小白蒿与溶剂料液比的选择：分别取1 000 mg 的小白蒿粉末， 置于 5、10、15、20、25、30 mL的溶剂中，即小白蒿与溶剂料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，浸泡后进行 1.3.3.1试验，测定其OD值，确定小白蒿总黄酮的浓度。根据参考文献[19]，各溶剂的总体积不同，小白蒿总黄酮提取率=（小白蒿总黄酮的测定浓度/小白蒿溶液的总浓度）×100%，根据小白蒿总黄酮提取率的大小，确定小白蒿与溶剂的料液比。

1.3.3.3 提取温度：分别取100mg的小白蒿粉末置于一定量的溶剂中， 选择 30、40、50、60、70、80 ℃进行回流提取，随后进行1.3.3.1试验，测定其OD值，确定小白蒿总黄酮的浓度，进而选择提取温度。

1.3.3.4 提取时间：分别取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的溶剂中，选择 0.5、1、2、3、4、5 h 进行回流提取，随后进行1.3.3.1试验，测定其OD值，确定小白蒿总黄酮的浓度，进而选择提取时间。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁系列标准溶液的终浓度（mg/mL）为X值，相对应的OD510nm值的平均值为Y值 （重复3次），得到线性回归方程y=9.6084x-0.0139，R2=0.9971。建立的芦丁标准曲线见图1，以芦丁的浓度来反映总黄酮的含量。

图1 芦丁标准曲线

2.2 最大检测波长

由图2可知，当检测波长小于490 nm时，OD值逐渐升高；当检测波长大于等于490 nm且小于等于520 nm时，OD值逐渐增加至峰值，并趋于稳定；当检测波长大于520 nm时，OD值逐渐降低。根据相关参考文献[12，17]及多次试验结果，确定最大吸收光谱，选定相对稳定的最大OD测定值，重复3次得到平均值，最后确定检测波长为510 nm。

2.3 小白蒿总黄酮的提取

图2 全波长扫描结果

2.3.1 提取溶剂种类及其浓度的选择：根据前期抑菌预试验及相关参考文献[12，17-18]，发现使用乙醇（50%～100%）的效果最好，且纸片法测定抑菌圈大小的结果也表明选择乙醇（50%～100%）作为溶剂的抑菌强度最强，之后对不同浓度的乙醇（50%～100%）进行了测定试验，结果见图3。随着乙醇浓度逐渐升高，其OD测定值逐渐升高，即小白蒿总黄酮的浓度逐渐升高，当乙醇浓度为60%时，OD值达到峰值，之后随着乙醇浓度的升高，OD值基本趋于平衡，略有下降，当乙醇浓度高于70%之后，OD值在急速下降后趋于平衡。急速下降的原因可能是随着乙醇浓度的升高，小白蒿中的水溶性黄酮类物质析出逐渐减少，脂溶性的其他物质析出逐渐增多，两者竞争性地争夺溶剂，从而导致溶剂中的黄酮类物质逐渐减少[19]。因此，当乙醇浓度为60%时小白蒿总黄酮的浓度最大，故选择小白蒿总黄酮的提取溶剂为60%的乙醇。

图3 乙醇浓度的选择

2.3.2 小白蒿与溶剂料液比的选择结果：小白蒿与 60%乙醇的料液比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30， 浸泡后进行 1.3.3.1 试验， 测定其 OD值，但因测定溶液的总体积不同，故影响其浓度，根据参考文献[19]，计算小白蒿的总黄酮提取率，以其提取率的大小来选择小白蒿与60%乙醇的料液比。由图4可知，图中X轴1～6序号分别表示料液比为 1∶5（序号 1）、1∶10（序号 2）、1∶15（序号 3）、1∶20（序号 4）、1∶25（序号 5）、1∶30（序号 6），Y 轴表示相应料液比下的小白蒿总黄酮提取率（%）。当60%乙醇体积逐渐增大时，小白蒿的总黄酮提取率也在逐渐升高；当小白蒿与60%乙醇的料液比达到1∶25（序号5）时，小白蒿的总黄酮在60%乙醇中充分溶解，已经达到饱和，故小白蒿的总黄酮提取率升高到最大值，并在之后稍微降低，因此，选择小白蒿与60%乙醇的料液比为1∶25（序号5）。

图4 小白蒿与60%乙醇料液比的选择

2.3.3 提取温度的选择结果：分别取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的60%乙醇溶液中，小白蒿与 60%乙醇的料液比为 1∶25，选择 30、40、50、60、70、80℃进行回流提取后，随后进行1.3.3.1试验，测定其OD值。由图5可知，当提取温度在30～50℃时，其OD值基本平衡，变化不明显；之后，随着温度逐渐升高，分子的运动增强，其OD值也逐渐升高，即小白蒿总黄酮的溶出量逐渐增大，当温度达70℃时，OD值达到峰值；当温度升高到70℃之后，物质结构遭受到高温的破坏，除了总黄酮以外的其他杂质的溶出量也相应增加，OD值下降，小白蒿总黄酮浓度降低，因此，选择小白蒿总黄酮的最佳提取温度为70℃。

图5 提取温度的选择

2.3.4 提取时间的选择结果：分别取100 mg的小白蒿粉末置于一定量的60%乙醇中，小白蒿与60%乙醇的料液比为 1∶25，选择 0.5、1、2、3、4、5 h进行回流提取，随后进行1.3.3.1试验，测定其OD值。由图6可知，当提取时间在0.5～2 h时，其OD值逐渐升高，且增加的速度较快；2 h之后，其OD值增加的速度放缓，接近饱和状态，之后随着提取时间的延长，其OD值升高，考虑可能是因为高温析出其他的活性物质或是其他干扰物质，以及自身有效成分的破坏损失，故选择4 h为最佳提取时间。

图6 提取时间的选择

3 小结

该研究以传统中蒙兽药小白蒿为主要研究对象，对传统的紫外分光光度法测定其总黄酮浓度的方法进行了优化。利用单因素试验设计，分别考查了溶剂及其浓度、小白蒿与溶剂的料液比、提取温度以及提取时间等一系列提取条件对小白蒿总黄酮提取效果的影响，确定了小白蒿总黄酮类物质的最佳提取工艺：提取溶剂选用60%的乙醇，小白蒿与60%乙醇的料液比为1∶25，提取温度为70℃，提取时间为4 h。试验得出的最佳提取工艺可以对蒙药小白蒿黄酮类物质进行进一步的分离提纯，进而开展其他的蒙兽药开发试验研究工作，为该药物在兽医临床上的应用奠定了基础。