关岭牛pEGFP-N3-UCP3重组真核表达载体的构建

代振新 ，陈 伟 ，2，3，4，韩 雪 ，许厚强 ，2，3，吴国文 ，申 勇 ，熊元松

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；4.贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳550025；5.贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550025）

线粒体解偶联蛋白3（uncoupling proteins 3，UCP3）是UCP家族中分布最广泛、表达最广泛的成员[1]。至今为止，哺乳动物体内已识别出5种解偶联蛋白， 分别为 UCP1、UCP2、UCP3、BMCP1/UCP4 和 UCP5[2]。 UCPs是完整的线粒体内膜的膜蛋白，其功能是作为质子运载体，使跨线粒体内膜的质子电化学梯度消失（称为“质子漏”），ADP不能进行磷酸化生成ATP，结果是物质氧化与ATP生成脱偶联而成为产热过程，UCPs在生热中起着重要的作用[3]。UCP3主要在骨骼肌中表达，在褐色脂肪组织和心肌中也有少量表达[4]。目前国内外学者对UCP3基因开展了广泛研究，结果表明，UCP3基因表达具有组织特异性[5]，肌肉UCP3过表达模仿耐力训练将减少不彻底β-氧化的循环生物标志物[6]。UCP3参与产热过程，也可对线粒体呼吸起解偶联作用，主要功能是调节脂肪酸代谢和减少活性氧的产生[7]。UCP3蛋白具备的生理、生化重要作用显示它是参与骨骼肌能量代谢的重要靶蛋白，对与机体能量平衡相关的肥胖、静止代谢率以及体脂代谢等作用的调控具有显著影响[8]。关岭牛适宜于山区放牧，以体质健壮、肉质良好、耐粗饲、易管理、适应山地环境而著称，是山区农业生产重要的使役动物[9]。同时，关岭牛养殖也是带动山区经济发展、促进农民增收的重要途径。因此，该试验以关岭牛为研究对象，从关岭牛UCP3基因的启动子入手，将其与不含CMV区的pEGFP-N3片段平末端连接，构建pEGFP-N3-UCP3重组质粒，为今后进一步探究UCP3基因的转录调控功能奠定基础。

图1 UPC3启动子片段PCR扩增产物

1 材料与方法

1.1 试验材料

pEGFP-N3绿色荧光蛋白载体由笔者所在实验室保存；T4 DNA连接酶、DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；血液基因组DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司；E.coli DH5α感受态细胞、高保真DNA聚合酶、dNTP购于鼎国公司。

1.2 试验方法

1.2.1 PCR扩增UCP3启动子：根据GenBank中公布的牛UCP3（NM_174210）基因序列，采用Primer 5.0软件设计牛UCP3基因5′端加磷的引物，上游引物序列为5′-TACCCTCAGTGCCTATCA-3′， 下游引物序列为 5′-GCCATTTGCTGGTGTCT-3′，引物由恒因生物技术有限公司合成。以关岭牛血液基因组DNA为模板扩增UCP3启动子，PCR扩增体系为20 μL。PCR条件为：98℃预变性 3 min；98℃变性 10 s，59℃退火 30 s；72℃延伸2 min，30个循环；72℃延伸7 min；4℃保存。反应产物利用1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 PCR扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段：以pEGFP-N3质粒为模板进行PCR扩增。上游引物序列为：5′-GCTAGCGCTACCGGACTCAGAT-3′，下游引物序列为：5′-ATTAATAACTAATGCATGGCGG-3′。 PCR 总反应体系为 20 μL。 PCR扩增条件为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，10个循环；98℃变性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，25个循环；72℃延伸10 min；12℃保存。反应结束后，用1.0%琼脂糖凝电泳检测PCR产物[10]。

图2 不含启动子区的pEGFP-N3载体片段PCR扩增产物

1.2.3 构建不含CMV区的pEGFP-N3-UCP3重组表达载体：将PCR获得的UCP3启动子片段用胶回收试剂盒回收纯化。将胶回收产物与不含CMV区的pEGFP-N3片段平末端连接，16℃连接过夜，经转化后挑取5～6个单菌落分别接种于5 mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床培养12～16 h，菌液经PCR鉴定后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 UCP3基因启动子片段的扩增

以提取的关岭牛血液基因组DNA为模板进行PCR扩增，产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，PCR扩增产物在1 080 bp处出现条带，与目的条带大小一致（见图1）。

2.2 扩增不含CMV区的pEGFP-N3载体片段

以pEGFP-N3空质粒为模板，利用PCR技术扩增不含CMV启动子的pEGFP-N3载体片段，结果显示，获得的片段大小与目的条带一致（见图2）。

2.3 重组载体pEGFP-N3-UCP3的鉴定

对阳性重组质粒进行菌液PCR鉴定，产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果表明，PCR扩增产物的片段大小为1 080 bp，与预期片段大小一致，而阴性对照则没有目的片段出现（见图3）。PCR检测后送测序，测序比对结果与原序列一致（见图4），表明UCP3启动子替代CMV启动子的重组载体pEGFP-N3-UCP3构建成功。

图3 阳性重组质粒菌液PCR鉴定结果

3 讨论

研究表明，在蛋白水平，UCP3是唯一在骨骼肌中表达的解耦联蛋白，这使得UCP3受到很多研究者的关注。当进入线粒体的脂肪酸（fatty acid，FA）超过其β-氧化能力时，UCP3可以从线粒体基质中输出脂肪酸阴离子或脂质过氧化产物，从而防止脂肪酸或脂质过氧化产物在线粒体内堆积而引起损伤，并促进脂肪酸的代谢。另外，UCP3可以减少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生，从而阻止或减少氧化性破坏[11]。近期研究发现，距离UCP3基因启动子上游1 500个碱基对的一个区域可驱动褐色脂肪组织特异性表达。当啮齿类动物处于寒冷的环境中 （非颤抖寒冷诱导的生热）或摄入过量食物（促进膳食诱导的生热）时，褐色脂肪组织起重要的作用[3]。近年来，国内学者针对南阳牛[12]和中国西门塔尔牛[13]UCP3 基因多态性与生长和育肥性状的关联开展了一些研究，证实其可作为牛早期选育的有效标记，并建议将UCP3基因作为肉牛生长及育肥性状的候选基因，用于肉牛的标记辅助育种。

4 结论

成功构建了不含CMV启动子区的重组真核表达载体pEGFP-N3-UCP3，为UCP3基因转录调控的研究奠定了基础。

图4 测序比对结果