侧脑室注射EGb 761对MCAO大鼠神经细胞凋亡的影响※

孙灵芝 孟苗苗 刘 芹 曹晓岚

（1 山东中医药大学附属医院脑病科，山东 济南 250011；2 山东中医药大学中医学院，山东 济南 250014；3 山东中医药大学第一临床医学院，山东 济南 250014)

目前，缺血性脑卒中具有较高的发病率和致残率，却缺乏有效的治疗措施。溶栓治疗是循证医学证实有效的疗法，因时间窗的限制而难以使大部分患者获益。

近年来，人们认识到缺血-再灌注损伤是缺血性脑卒中的重要损伤机制，而细胞凋亡又是缺血-再灌注损伤的重要发病环节。脑梗死时，梗死中心区域的神经元因严重缺血而导致早期坏死，而周围半暗带的神经元则发生迟发性凋亡。c-fos基因属于即早基因家族，能在受到外界刺激后10～30 min内，转录形成mRNA。脑内正常水平的c-fos基因表达有一定保护作用，过度表达的Fos蛋白则会转入细胞核内与c-jun基因的表达产物Jun蛋白结合生成异源二聚体，作用于转录环节，可引起细胞凋亡[1-2]。

我们采用侧脑室注射技术，观察EGb 761对大脑中动脉缺血-再灌注大鼠皮层区梗死灶周围凋亡细胞、fos、c-jun基因表达，探讨其作用机制，及侧脑室注射技术的可行性。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级健康雌性SD大鼠，体质量（250±20）g。购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，SPF级环境适应性饲养7 d。

1.2 药品和试剂 EGB 761（7320400，German Weimar Dr.Shu Pei pharmaceutical factory， Inc)；10%水合氯醛，鲁药准字再H01080291，产品批号：20110601；0.9%氯化钠注射液，250 mL，山东金洋药业有限公司，国药准字H37021678，产品批号12.95412；兔抗c-fos、c-jun抗体（北京中杉生物有限公司）；DAB显色液（京博奥森生物工程有限公司）；TUNEL试剂盒 (Roche，Germany)，Mouse polyclonal to Brdu (Santa Cruz biotechnology， Inc)，工作浓度：1∶100；Mouse polyclonal to NCAM (Merck Millipore)，工作浓度：1∶100；Goat anti Mouse IgG-FITC (Santa Cruz biotechnology，inc)，工作浓度为1∶100。正常羊血清封闭液 (福州迈新生物技术开发有限公司)。柠檬酸抗原修复液 (PH6.0)(福州迈新生物技术有限公司)。PBS柠檬酸缓冲液(PH7.4) (福州迈新生物技术有限公司)。防脱片剂：0.1%多聚赖氨酸 (北京中杉金桥生物技术有限公司)。光学显微镜（德国leicaDM4000B）；leica Qwin V3图像分析软件（德国）。

1.3 分组、模型制备及神经功能评分 将大鼠随机分为注模型组、治疗组及假手术组，每组10只。5只用于TUNEL检测，5只用于C-FOS、C-JUN检测。用插线法制备大脑中动脉阻断的缺血再灌注模型[3]。大鼠10%水合醛麻醉后，沿颈正中切开，仔细分离右侧颈内外动脉 (ICA，ECA)，将ECA结扎并剪断，拉直与ICA成一直线，将一根长4.0 cm，直径0.26 cm的圆头硅化尼龙线由ECA插入ICA1.85～2.00 cm，进颅至大脑中动脉起始处，而假手术组仅插入9 mm。缺血2 h后小心抽出尼龙线，结扎ECA开口处，缝合切口后放回笼中。再灌注2 h后处死动物。选取评分为1～2分的大鼠为模型鼠，进行后续的检测。待大鼠术毕清醒后，参照Zea Longa分制法[4]进行神经功能缺损评分:0分:无神经功能缺损症状；1分:提尾倒挂时左前肢紧贴胸壁不能伸展；2分:行走时向左侧转圈；3分:行走或站立时向左侧倾倒；4分:意识障碍，不能行走。选取1～3分者进行后面的连续检测。

1.4 给药方法 脑缺血后即时给予侧脑室注射EGb 761或等量生理盐水。用10%的水合氯醛 (0.3 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，矢状突切开头皮至颅骨，参照Paxinos-Watson图谱，以前囟为基点，后移3.5 mm，右移3.5 mm钻开颅骨，以颅骨表面为准垂直进针3.8 mm，用微量注射器将0.525 mg/kg EGb 761(0.1 mL/h)注入侧脑室，注射结束后留针10 min，再撤出微量注射器，骨蜡封闭小孔，常规局部消毒、缝合切口，麻醉管理，待苏醒[5]。

1.5 取材及组织切片样本制备 腹腔注射10%水合氯醛（0.06 mL/kg）麻醉大鼠，暴露心脏，穿刺左心室，插管入升主动脉，剪开右心耳，以250 mL生理盐水快速灌注至肝脏变白，以含4%多聚甲醛的PBS（0.1 mol/L，pH7.4）灌注固定，0.5 h后取出全脑，置入4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS（pH7.4，4℃） 后固定；8 h后放置于含20%蔗糖的磷酸缓冲液中，待脑组织下沉，进行冰冻切片；根据大鼠脑组织立体定位解剖图谱，将脑组织切成厚30 μm的切片，用于c-fos、c-jun、TUNEL。

1.6 细胞凋亡检测 采用原位末端标记法 (TUNEL)检测细胞凋亡，操作方法严格按照试剂盒说明书进行，细胞核染色呈紫褐色者视为TUNEL染色阳性神经元。选取脑额顶部皮层部位，200倍光镜下计数5个视野阳性细胞数目，求其平均值。

c-fos、c-jun检测：将脑片置于37℃正常羊血清工作液封闭，中孵育1 h，滴加一抗4℃冰箱孵育过夜；转至室温平衡30 min，PBS冲洗3×10 min；滴加荧光二抗，37 ℃避光孵育60 min，PBS冲洗4×10 min；DAB显色，复染；梯度酒精脱水；二甲苯透明2次，中性树胶封片[6]。光镜下，阳性细胞细胞核染色体呈现棕黄色，多为圆形或者卵圆形。各组大鼠每张脑片随机选取5个视野，分别对c-fos、c-jun阳性细胞进行计数并利用leica Qwin V3图像分析软件分析其平均灰度。

1.7 统计学方法 用SPSS 22.0进行统计学处理，采用单因素方差分析，结果用（±s）表示。

2 结果

2.1 神经行为学观察 术后2 h左右大鼠清醒时进行评分，分值越高，动物行为障碍越严重。有以下症状：画圈运动，站立不稳，左侧倾倒，不能完全伸展左侧前爪，经统计分析，除假手术组外无明显缺血行为表现外，其余各组均表现为神经行为学异常。

2.2 对缺血-再灌注大鼠皮层区梗死灶周围TUNEL阳性细胞计数的影响 各组不同时间点均有TUNEL阳性表达细胞。凋亡细胞胞核呈紫褐色着色，胞核固缩，颗粒深染，呈椭圆形、圆形及不规则形。假手术组第7天，第14天均有少量阳性细胞。与假手术组相比，模型组第7天，14天大鼠区TUNEL阳性细胞数均明显增多 (P＜0.05)，第7天更为显著，提示MCAO可引起梗死灶周围神经细胞凋亡；在各时间点，与模型组比较，治疗组阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义 (P＜0.05)，提示治疗组大鼠海马区神经元调亡减少 (图1)。第14天，模型组及治疗组凋亡细胞数均有下降。

图1 缺血再灌注大鼠脑组织皮层梗死周边区TUNEL阳性细胞表达(×200)

假手术组、模型组和治疗组TUNEL阳性细胞：图1是对TUNEL阳性细胞的定量分析。模型组TUNEL阳性细胞较假手术组明显增多（P＜0.01），治疗组TUNEL阳性细胞较模型对照组明显减少（P＜0.05）。

2.3 对缺血-再灌注大鼠皮层区梗死灶周围c-fos和cjun阳性细胞数的影响 镜下c-fos、c-jun基因蛋白染色呈棕褐 (黄)色。假手术组仅见少量阳性细胞，模型组大鼠脑神经元、神经胶质内c-fos和c-jun阳性细胞数较假手术组明显增多（P＜0.01），治疗组c-fos和 c-jun阳性细胞数较模型组显著减少（P＜0.05），提示缺血-再灌注大鼠模型可显著提高c-fos和c-jun阳性细胞数，EGb 761对c-fos和c-jun阳性细胞数有抑制作用。

假手术组、模型组和治疗组c-fos、c-jun阳性神经细胞：图2A、2B是对c-fos、c-jun阳性细胞的定量分析。模型组c-fos、c-jun阳性神经细胞较假手术组明显增多（P＜0.01），治疗组c-fos、c-jun阳性神经细胞较模型组明显减少 （P＜0.05）。

3 讨论

脑缺血后即早基因的表达变化，与缺血后组织损伤、修复及神经网络的重建有关，其表达上调或下调可用于评价脑缺血的干预措施的有效性。Dragunow[7]研究发现，中度缺血缺氧可引起缺血侧神经元c-fos、cjun的快速诱导，且与迟发性选择性神经元死亡有关。蒋犁等[8]采用逆转录扩增、免疫组化和Tunel标记方法，在转录和翻译水平分析c-fos基因表达与脑海马迟发性神经细胞死亡的相关性。结果发现，缺氧缺血后脑海马c-fos mRNA即刻出现表达，至1 h左右达高峰，2 h后表达回落近基础水平；而对照组则无相应的表达曲线；c-fos蛋白表达较c-fos mRNA表达高峰时间迟约1 h，并持续于高水平。提示新生脑的神经元对损伤刺激不仅敏感，而且具有一定的耐受性。李一欣等[9]对新生大鼠脑缺血缺氧再灌注后不同时间段海马CA1、CA3区c-jun基因表达和凋亡细胞进行检测，发现缺血缺氧再灌注3、6、12、24、48、96 h后c-jun基因表达和凋亡细胞均高于对照组，6 h达高峰，7 d时与对照组无显著差异，提示c-Jun可能与轻度缺血缺氧再灌注后神经元的凋亡与修复有关。Yamaguchi[10]发现，脑缺血再灌注1～48 h内，大鼠脑内c-fos和c-jun的mRNA表达增高，而这种增高可被环孢菌素A明显抑制。董劲松等[11]发现，局灶性脑缺血可以引起c-fos在缺血侧脑区的广泛大量表达，而这种表达可被电针部分抑制，同时可见局灶性脑缺血动物模型的脑梗死灶体积减小；但脑内注射cfos反义寡核苷酸阻断c-fos表达，可导致脑梗死灶体积明显增大，提示脑内c-fos的过度表达是脑缺血损伤的机制之一，但其适度的表达，可能在脑缺血损伤中有一定的保护作用。

图2 c-fos、c-jun表达阳性神经元及神经胶质细胞（SP染色，×400）

脑缺血-再灌注损伤后，神经元和神经胶质细胞内均可见c-fos和c-jun表达，且其表达可受细胞内信号通路如神经生长因子 (nerve growth factor，NGF)、表皮生长因子 (epidermatic growth factor， EGF)、成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor，FGF)和白细胞介素-6 (interleukin 6，IL-6)等诱导，参与神经突触可塑性的调节[12-15]。

EGb 761是银杏叶的提取物，含有多种相互作用的有效成分 (如黄酮糖苷、银杏苦内酯、白果内酯、先期花色素及少量酚酸)，具有多价性的药理学作用。研究证实，EGb 761抗氧化、清除自由基，抗缺血引起的细胞凋亡等作用[16-19]。由于血脑屏障仅允许脂溶性小分子物质有效透过，限制了许多药物疗效的发挥，近几年作为一种系统性用药技术，侧脑室注射技术可提高治疗的靶向性，有效提高损伤局部血药浓度，被越来越多地应用于实验研究，并获得了良好的效果[20-22]。EGb 761具有水溶性和脂溶性双重特性，分子量较大，只能部分透过血脑屏障，因此，我们采用侧脑室注射技术以提高其缺血-再灌注损伤局部血药浓度，以提高其靶向性疗效。

本研究提示，大脑中动脉脑缺血-再灌注模型可引起皮层梗死灶周围神经细胞凋亡及c-fos、c-jun的过度表达；而侧脑室注射EGb-761可抑制细胞凋亡，下调cfos、c-jun的过度表达，上调海马区内源性神经干细胞的发生，这可能是其抗缺血-再灌注损伤的分子机制之一，为侧脑室注射EGb 761用于脑缺血-再灌注损伤的治疗提供了理论依据。