天龙组方对肾虚证COPD大鼠肺功能及炎症因子的作用※

周海祥 赵钦绵 夏鑫华*

（1 江西吉安市中心人民医院中医科，江西 吉安 343000；2 广州医科大学附属第一医院中医科，广东 广州 512000）

慢性阻塞性肺疾病 (COPD)是常见的呼吸道疾病，发病率及死亡率均较高。世界卫生组织预言到2020年，COPD在“全球疾病死亡率”的排名将上升到第3位[1]。目前，现代医学对COPD的治疗一直未有实质性突破。常用的药物治疗只能缓解症状和/或并发症，但不能扭转COPD肺功能的长期下降[2]。尤其是在COPD的稳定期，长期应用支气管扩张剂或糖皮质激素治疗，副反应大，费用昂贵，且不能避免患者的反复感染，导致疾病缠绵难愈，病情进行性加重，患者的生活质量严重下降，最终危及生命[3]。COPD的病理生理变化趋于影响全身各系统[4]，不断恶性循环，使其防治措施更加复杂化，因此单一治疗方法已不能取得较好的疗效，近年的研究成果也从不同角度显示出，中医药对COPD发生发展过程中各病理环节都有一定的作用。

本研究选用临床疗效确切的天龙组方，在以往的研究基础上，通过对肾虚证COPD模型大鼠肺功能及炎症因子IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α的蛋白表达等方面的研究，探讨天龙组方对肾虚证COPD大鼠模型的干预作用及可能的分子机制，为中医防治COPD提供新的思路和方法，具有一定的理论意义和较广阔的临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SPF级Wistar大鼠，体质量 (260±20)g，购自广东省实验动物中心，生成许可证号：SCXK(京)2012-0001，饲养在广州医科大学附属第一医院，室温（22±2）℃，相对湿度30%～40%，常规饲料喂养，自由进食饮水，适应性饲养1周后用于实验。

1.2 试剂和仪器 水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：20110401）；ECL Plus发光试剂盒、SDSPAGE蛋白上样缓冲液（5×）、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α单克隆抗体 （abcam公司）；goat anti-rabbit（二抗，bioworld公司）；酶标仪（SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司）；电泳系统（Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司）；凝胶成像仪（ChemiDoc XRS+System，Bio-RAD公司）。

1.3 肾虚证COPD大鼠模型的复制 用熏吸香烟加气管内注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，在皮下注射醋酸氢化可的松建立复合肾虚证模型。第1 d、14 d气道内注入脂多糖 (LPS)0.2 mL (1 μg/μL，美国Sigma公司)，第2～13 d及第15～28 d放入自制的玻璃箱内烟薰(红双喜烤烟型香烟，每天2次，每次1 h)；第22天起背部皮下注射浓度为25 mg/mL的醋酸氢化可的松，每天0.3 mL/只，连续8 d。

1.4 药物、动物分组及给药方法 天龙组方主要组成：青天葵10 g，款冬花15 g，法半夏10 g，制附片30 g，五味子5 g。购于广州医科大学附属第一医院，10倍量水煎煮2次，滤液浓缩后冷冻干燥成粉，临用前蒸馏水适量复溶。依据70 kg成人用量折算成大鼠等效剂量。

雄性SPF级Wistar大鼠，体重 (260±20)g，随机分为4组，正常组、模型组、天龙组方组、布地奈德组，每组10只。

正常组：第1 d、14 d气道内注入生理盐水0.2 mL，第2～13 d及第15～28 d将大鼠放入自制的0.22 m3玻璃箱内 (每天2 h)，不用烟薰。在气道内注入生理盐水前3 d及第2～13 d，第15～28 d在放入箱前用生理盐水灌胃 (10 mL/kg/d)；模型组：按肾虚证COPD大鼠模型的复制方法造模，造模前3 d， 第2～13 d及第15～28 d用生理盐水灌胃 (10 mL/kg/d)；天龙组方组：按模型组方法造模，造模前3 d，第2～13 d及第15～28 d用天龙组方煎剂灌胃（10 mL/kg/d，大鼠给药剂量按体表面积公式换算）；布地奈德组：按模型组方法造模，每只大鼠从第21 d起每天薰烟前用雾化器在一密闭容积内雾化吸入布地奈德混悬液，浓度为0.5 g/L的液体8 mL，50 min，余处理同模型组。

1.5 研究方法

1.5.1 肺组织形态学测量 取右肺下叶标本，用10%中性甲醛固定24 h，石蜡包埋、苏木精染色、切片。光镜下观察大鼠肺组织，确定COPD的病变及其治疗效果。

1.5.2 肺功能测定 造模24 h后，大鼠分别用10%水合氯醛麻醉，并固定于手术板，纵向切开颈部皮肤约2 cm，分离皮下组织，暴露气管，于环状软骨处作2个倒T型切口，插管后连接肺功能仪，将大鼠固定于体描箱内。观测大鼠通气功能主要指标包括检测大鼠FVC（用力肺活量），FEV1（第一秒用力呼气容积），FEV1/FVC，FEF25%（用力呼气流量25%），MMF（最大呼气中期流速），PEF（最大呼气流速）等肺功能指标。

1.5.3 ELISA法检测 支气管肺泡灌洗液BALF中IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α炎症因子的水平采用的双抗体免疫组化法测定样品中IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α的水平。在预先包被IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α单克隆抗体的酶栋孔中加入样品，温育；温育后，加入生物素标记的抗IL-6，IL-8，NF-κB，TNF-α抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，再经过温育和洗涂，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中IL-6，IL-8，NF-κB， TNF-α的浓度呈线性。具体试验操作参考试剂盒标准操作流程。

2 结果

2.1 肺组织病理结果 肺组织病理切片经H&E染色，在光学显微镜下可见：正常组大鼠气道上皮结构完整，纤毛排列整齐，肺泡结构正常。模型组大鼠细支气管狭窄变形，呼吸性支气管管腔狭小甚至闭塞，管壁明显增厚，有小叶中型肺气肿和全小叶型肺气肿形成，肺间质增宽，间质中可见大量的炎性细胞浸润，部分肺泡壁变薄，呈丝状连接，多个肺泡融合形成肺气肿。天龙组方组和布地奈德组大鼠的肺组织部分由肺间质增宽，间质偶有炎性细胞浸润，病理损害轻重程度与模型组不同，经治疗后肺泡扩张和炎性浸润得到明显改善。

图1 不同组别大鼠肺组织H&E染色病理切片

2.2 肺功能指标 如表1所示，与正常组相比，模型组FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、MMF水平显著下降(P<0.05)；与模型组相比，各用药组FVC、FEV1、FEV1/FVC、FEF25%、MMF水平均显著提高 (P<0.05)。说明各用药组大鼠的肺功能经不同药物治疗后均得到不同程度的改善。

表1 不同组别间肺功能指标数据表 （±s）

表1 不同组别间肺功能指标数据表 （±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 FVC FEV1 FEV1/FVC正常组模型组天龙组方组布地奈德组21.40±1.32 12.13±1.82**17.64±1.96##18.01±1.34##36.87±2.58 28.51±1.99*34.60±2.75#33.91±3.18#1.72±0.35 2.35±0.51**1.96±0.27##1.88±0.64##FEF25% MMF 48.17±1.98 36.89±1.54**44.77±1.91#45.67±2.17#45.73±2.36 36.28±1.88*46.19±3.51##42.14±2.61#

2.3 BALF液中IL-6， IL-8， NF-κB， TNF-α的含量如图2～5所示，模型组大鼠BALF液中炎症因子IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α比正常组显著升高，提示造模成功。给予天龙组方干预COPD大鼠后，炎症因子IL-6，IL-8， NF-κB， TNF-α显著下降，说明天龙组方可以对抗COPD过程中炎症因子的释放，缓解慢性炎症，从而起到治疗的药效。同时，天龙组方药效与阳性对照药基本一致或稍优，提示其在COPD临床治疗中具有一定的应用前景。

图2 不同组别间BALF液中IL-6含量比较图

图3 不同组别间BALF液中IL-8含量比较图

图4 不同组别间BALF液中NF-κB含量比较图

图5 不同组别间BALF液中TNF-α含量比较图

3 讨论

COPD按其临床表现一般归属为中医的“喘证”“肺胀”“水肿”等范畴，多为久咳、久哮、久喘迁延不愈发展而成。中医药对COPD的防治已取得一定的成效，研究内容主要集中在COPD的病因病机，临床治疗及中医药作用机理等方面。对COPD的病因病机研究，主要集中在痰、瘀、虚三个方面，中医认为内在的脏腑功能失调导致的肺脾肾虚、痰浊、血瘀为本病的内在病机病理变化，多倾向本虚标实，本虚以肺脾肾虚为主，标实为痰瘀为主，故临床治疗时应“标本兼顾”，虚实同治。

课题组在长期的临床研究中发现：COPD患者因长期咳、痰、喘，耗伤肺气，损及脾肾，致痰浊内蕴，瘀滞内生，痰瘀郁久亦易化热，其标在肺，其本在脾肾。因而在急性期后仍具痰热余邪依恋不清、壅塞肺气的病机。故其治疗应在清肺化痰的同时，注意温肾化痰与活血逐瘀。温肾则气纳喘平，活血则瘀去痰易化。本项目组选用的天龙组方是由国家第二批名老中医、中医呼吸疾病专家邱志楠教授根据多年临床经验，结合COPD的病机特点，创制的以“温肾活血化痰”为主要治法的中药复方。方中主要药物熟附子可振奋肾中之元阳，复其气化卫外之能；青天葵为兼治痰瘀热之品，消痰解毒化瘀又不伤阴血耗气，款冬花温肺平喘；法半夏温化痰饮，燥湿降逆，又能健运脾气；五味子敛肺而滋肾。全方温肾纳气并举，攻补兼施并用。经大量的临床检验，疗效确切，可显著改善COPD患者缓解期的咳、痰、喘等症状，提高生活质量，较好地保护肺功能，减缓肺功能下降，提高FEV1/FVC%、MMEF等指标。