复合酶法优化川牛膝多糖提取工艺研究

叶秀娟 黄颖贤 李少凤

川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根[1-3]，其性平，味甘、微苦，归肝、肾经，具有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋的功效，主要分布于四川、贵州、云南等地区。川牛膝含有的水溶性物质——多糖[4-5]为活性物质，其具有增强免疫力，抑制肿瘤转移、保护肝脏、升高白细胞的功能，常用于免疫调节和肿瘤治疗等，因此对川牛膝多糖的研究有较高的应用价值。研究川牛膝多糖首先需要将多糖最大限度的提取出来，近年来对川牛膝多糖的常规提取研究主要集中在水煮法、超声法等，已有的常规方法具有损失大、工序多、周期长、提取率低等缺点，因此迫切需要开发新的提取方法为工业大规模提取多糖提供技术上的支持。酶在适当的条件下具有一定的活性，尤其是纤维素酶对植物细胞壁有很好的作用。本研究旨在用正交试验复合酶法[6]优化川牛膝多糖的提取工艺，为工业大规模提取提供技术支持和后期研究川牛膝多糖奠定理论基础，现报道如下。

1 材料、仪器与试验材料

川牛膝（安徽亳州生产，批号：20170920）；中草药粉碎机（许昌市豫邦机械制造有限公司生产，型号：ZY-C350）；紫外分光光度计（济南思泉医疗器械有限公司生产，型号：TU-1810）；恒温磁力搅拌器[珩衍谨诚（北京）科技有限公司生产，型号：85-2]；高速离心机（赛默飞生产，型号：赛Sorvall LYNX4000）；电子天平（赛多利斯生产，型号：BSA224S）；旋转蒸发仪（上海越众仪器设备有限公司生产，型号：R201D）；pH计（赛多利斯生产，型号：PB-21）；蒸馏水（屈臣氏生产）；葡萄糖（天津市凯通化学试剂有限公司生产，分析纯）；苯酚、浓硫酸（国药集团化学试剂有限公司生产，分析纯）；乙醇（OMNI生产，分析纯）；纤维素酶（酶活力≥400 U/mg，批号：20171213）、蛋白酶（酶活力≥100 U/mg，批号：20180324）、果胶酶（酶活力≥500 U/mg，大连美伦生物技术有限公司生产，批号：20171120）。

2 方法与结果

2.1 多糖提取流程取干燥的川牛膝→粉碎→筛分→称取→提取→调节 pH值→复合酶提取→灭酶→抽滤→减压浓缩→醇沉过夜→离心分离→沉淀复溶→粗多糖溶液。

2.2 操作要点将川牛膝用粉碎机粉碎后过 80目筛，备用。称取约10 g川牛膝粉末，按料液比加入蒸馏水，提取；提取后加入缓冲液并用酸度计调节pH值，按纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=1:1:1加入一定质量的复合酶，于恒温磁力搅拌器上恒温提取60 min后，90℃灭酶 10 min；真空抽滤机抽滤，取滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至30～50 ml，向浓缩液中加入3倍体积分数为95%的乙醇，4℃条件下醇沉过夜；4000 r/min离心15 min后收集沉淀，加入蒸馏水复溶，即得出多糖溶液。

2.3 川牛膝多糖含量测定

2.3.1 葡萄糖标准曲线绘制精密称取葡萄糖对照品20.00 mg至100 ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释定容至刻度，摇匀后即得浓度为0.2 mg/ml的葡萄糖对照品储备液。分别量取对照品储备液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml、6.0 ml、7.0 ml置于 50 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，备用。按照苯酚-硫酸法显色，在490 nm下紫外扫描测定吸光度，记录葡萄糖浓度（X）相应的吸光度（Y），并绘制标准曲线，得标准曲线为：Y=11.125X+0.0281（r=1.000）,在0.008～0.056 mg/ml浓度范围内线性良好（图1）。

图1 葡萄糖标准曲线图

2.3.2 含量测定取川牛膝多糖溶液适量，于50 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释，定容至刻度，摇匀。按照苯酚-硫酸法显色，在490 nm下紫外扫描测定吸光度，带入2.3.1项下的线性方程计算浓度，进而推算多糖含量。计算公式：多糖得率=nCV0/（100 m）×100%。针对公式特殊说明：C为提取的川牛膝多糖样品液的质量浓度（mg/ml）；n为稀释倍数；V0为川牛膝多糖样品液的总体积（ml）；m为称取的预处理的川牛膝粉的质量（g）。

2.4 正交试验

2.4.1 优化川牛膝多糖提取工艺在预实验单因素考察的基础上，用正交试验对复合酶法提取川牛膝多糖进行优化，选取料液比（g/ml）、复合酶（纤维素酶:果胶酶:蛋白酶=1:1:1）用量（%）、pH 值、温度（℃）4个对结果影响较大的因素，在3水平上用多糖含量作为评价指标设计正交试验L9（34），因素水平设计如表1。

表1 正交试验主要因素与水平表

表2 复合酶法优化川牛膝多糖提取工艺正交试验结果

由表2结果直观分析可得，以多糖含量为考察指标，四个因素影响程度依次为 C＞B＞D＞A，且A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1、D2＞D1＞D3可以得出，最佳工艺条件为A1B2C3D2。

表3 复合酶法优化川牛膝多糖提取工艺方差分析表

由表3方差分析可得，以多糖含量为考察指标时，因素C对试验结果有显著性影响，因素A、B和D对实验结果均无显著性影响，因此最佳制备工艺为A1B2C3D2，即料液比为 1:20（g/ml）、复合酶用量为0.7%、pH值为6.0、温度为45℃为最佳工艺条件。

2.4.2 验证性试验通过正交试验确定最佳制备工艺条件，并进行验证实验。按照计算出的多糖含量计算相对标准偏差来分析最佳公工艺条件是否稳定。平行制备6份，结果见表6。

表4 验证试验结果

结果显示，相对标准偏差（RSD）为0.09%，得出复合酶法优化川牛膝多糖提取方案的重现性较好，说明最佳提取工艺条件稳定可行。

3 讨论

通过正交试验[7-9]对复合酶法提取川牛膝多糖工艺进行筛选，得出最佳的提取方案为料液比为1:20（g/ml）、复合酶用量为0.7%、pH值为6.0、温度为 45℃。在最佳方案的基础上对该方法进行验证性试验，验证结果具有较好的重现性，该方法可行，可用于川牛膝多糖工业上的大规模提取。在确定葡萄糖测定的最大紫外吸收波长时，笔者从配制一定浓度的对照品溶液显色后在190～800 nm进行波长扫描，发现在490 nm处有较大的吸收，故确定490 nm为最大紫外吸收波长。本研究采用的复合酶可以将细胞壁溶解，能最大限度地增加多糖得率。酶[10]的活性容易受到温度、pH值等因素的影响，故将温度、pH值[11]作为正交试验的因素。预实验过程中先将其余 3个因素固定，只改变剩余的一个因素，考察这一因素在不同条件下的多糖得率，得出最佳的结果，其他单因素考察以此类推。

近年来，对于复合酶法提取药材中多糖的研究屡见不鲜，比如复合酶法提取白术多糖、枸杞多糖、海带多糖[12-14]等，可见复合酶法应用广泛。本研究也进一步证明复合酶法提取多糖可靠，易行。笔者研究复合酶法优化川牛膝多糖的最佳提取工艺为后续研究多糖活性奠定了物质基础。