胡椒木释放挥发性有机物成分及变化规律

蒋冬月，李永红 ，沈 鑫

（1. 浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2. 深圳职业技术学院，广东 深圳 518055）

胡椒木Zanthoxylum piperitum L.，是芸香科Rutaceae花椒属Zanthoxylum L.多年生常绿灌木。奇数羽状复叶，叶基有2枚短刺，叶轴有狭翼，小叶对生，叶面浓绿富光泽，具有香气；生长速度慢，具有耐热、耐寒、耐旱、耐风和耐修剪等特性，因此适于作盆栽、绿篱、地被和修剪造型等，是进行平面绿化和垂直绿化的良好材料[1]。胡椒木全株具浓烈的胡椒香味，是一种新兴的芳香植物，具有驱虫、杀虫和抗菌等功效[2]，日益受到人们的关注。近年来，随着植物挥发性有机物提取和检测技术的发展，植物挥发性有机物代谢、调控和机理的研究取得了较大的进展[3-7]，不同植物释放的挥发性有机物成分和变化规律成为热门的研究领域之一。目前，对胡椒木的研究主要集中在无性繁殖[8-9]、精油提取技术[10]和精油化学成分[11]、抑菌作用[12]、分子生物学[13]等方面，并未见胡椒木挥发性有机物成分及变化规律的文献报道。因此，本研究采用顶空-固相微萃取技术采集不同时期胡椒木叶片释放的挥发性有机物，结合气质联用仪检测并分析了胡椒木叶片不同季节和1 d中不同时间释放的挥发性有机物成分及相对含量，揭示其叶片释放挥发性有机物的季节变化规律和日变化规律，为科学利用胡椒木营造芳香保健型园林景观提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

胡椒木株龄5 a，种植于深圳职业技术学院西校区芳香植物园内。

1.2 试验方法

1.2.1 植物挥发性有机物的采集和测定

分别于2012年3、6、9、12月的15日上午8:00—10:00在同一位置的植株上摘取向阳一侧上、中、下部位的健康无损伤的叶片10片，剪碎混匀，称取0.5 g放置5 mL萃取瓶中密封，静置30 min，环境温度为22±3 ℃。将型号为DVBCAR-PDMS 100 μm的SPME纤维头通过聚四氟乙烯瓶垫插入到萃取瓶中，置于样品正上方0.5 cm左右，顶空萃取40 min，然后将纤维头插入6890N/5975气相色谱-质谱联用仪的GC进样口，解吸10 min。每次测定重复3次，吸附空萃取瓶中的气体作为空白对照。挥发性有机物日动态变化的测定于6月15日进行，8:00—20:00每2 h采样1次。

色谱条件:HP-5MS弹性石英毛细管柱色谱柱，长30 m，内径0.25 mm，液膜厚0.25 μm，载气为高纯氦气，不分流进样，恒流流速1.0 mL/min，进样口温度230 ℃，接口温度280 ℃。季节变化测定选择初始温度50 ℃，保持4 min，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以7 ℃/min升至250 ℃，保持8 min。日动态变化测定选择初始温度50 ℃，保持4 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。

质谱条件:电子轰击（EI）离子源，电子能量70 eV，离子阱温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，质量扫描范围30～500 m/z。

1.2.2 数据处理

挥发性有机物成分用气相色谱-质谱-计算机联用仪中MSD Productivity ChemStation进行分析鉴定。各组分质谱经NIST Mass spectral database 2008谱库检索，采用保留指数的方法来辅助质谱检索定性。各成分在样品气体中的浓度（相对百分含量）采用峰面积归一法进行计算，计算公式为:浓度=（该成分峰面积/样品所有气体峰面积之和）×100%。

通过该公式计算得出的结果代表了某物质在所采集的总气体样品中的相对百分含量，并非该成分在大气中的绝对浓度。

2 结果与分析

2.1 胡椒木叶片挥发性有机成分和含量的季节动态变化

通过GC—MS分析，扣除本底空气中的杂质，从胡椒木叶片1 a中不同季节释放的挥发性有机物中共鉴定出37种化合物（表1）。其中萜烯类化合物12种、酯类化合物10种、酸类化合物7种、醇类化合物4种，以及少量的烷类和醛类化合物；主要成分为肉桂酸甲酯、β-月桂烯和石竹烯等。3月到12月检测到胡椒木叶片释放的挥发性有机物种类先减少后增加，其中3月检测到的挥发性有机物种类最多，为24种；9月份最少，为8种（见图2）。

胡椒木叶片不同季节释放的挥发性有机物成分的种类和相对含量并不相同。3月份检测出的挥发性有机物种类主要为酯类、萜烯类和酸类物质，其中2-十八烯酸单甘油酯相对含量最高，为41.54%，其次为β-松油烯、软脂酸，2-羟基-1-羟甲基乙酯、硬脂酸，2-羟基-1-羟甲基乙酯和肉桂酸甲酯，其相对含量分别为26.45%、12.71%、5.71%和3.76%。6月份检测到的种类以酯类和萜烯类为主，醇类物质的种类较3月有所增多，而酸类物质的种类仅为3月份检测到的酸类化合物数量的三分之一；主要含有肉桂酸甲酯、β-月桂烯、1-亚甲-4-(1-甲基-乙烯基)-环己烷等物质。9月和12月份检测到的挥发性有机物种类主要是以萜烯类化合物为主，其中Cyclopentene,3-isopropenyl-5,5-dimethyl-的相对含量最高，达63%以上，其次为肉桂酸甲酯、β-月桂烯和石竹烯等物质。1 a中，每个季节都检测到的化合物有辛酸甲酯、肉桂酸甲酯、α-石竹烯、β-月桂烯和石竹烯。

图1 胡椒木叶片不同季节释放的挥发性有机物的总离子流图Fig.1 The TIC of VOCs released from leaves of Z. piperitum in different seasons

表1 胡椒木叶片释放的挥发性有机物成分及相对含量的季节变化†Table 1 The seasonal variations of components and relative contents of VOCs released from leaves of Z. piperitum

续表1Continuation of table 1

图2 1 a中不同季节胡椒木叶片挥发性有机物种类的变化Fig. 2 The component numbers of VOCs in different seasons of one-year-old Zanthoxylum piperitum leaves

表2 胡椒木叶片不同季节挥发性有机物成分及含量分类统计†Table 2 The components and relative contents of VOCs released from leaves of Z. piperitum in different seasons

从表2可以看出，1 a中不同季节，胡椒木叶片释放的酯类物质的相对含量呈现先下降后上升再下降的趋势，在3月份时含量最高，为64.56%，12月份最低，仅为3月份相对含量的四分之一；萜烯类化合物则呈现先下降后急剧上升的趋势，在12月份相对含量达到最高，为84.70%；烷类化合物的相对含量在6月份最高，为63.2%；酸类和醇类化合物仅在3月份和6月份检测到，且含量较低。胡椒木叶片释放的挥发性有机物主要成分肉桂酸甲酯、α-石竹烯、β-月桂烯和石竹烯的相对含量都随季节呈现低-高-低的变化趋势。

2.2 胡椒木叶片挥发性有机物成分和含量的日变化

在1 d中，胡椒木叶片释放的挥发性有机物种类共鉴定出72种化合物。其中萜烯类化合物21种、烷类物质16种、酯类化合物15种、酸类化合物8种、醛类和醇类化合物各4种，以及少量的酮类和其他类化合物；主要成分为肉桂酸甲酯、β-月桂烯、β-松油烯、α-石竹烯等。1 d中不同时段胡椒木叶片挥发性有机物的种类呈现先减少后增多再减少的趋势（图4）。8:00—10:00挥发性有机物种类急剧减少，之后随着时间的推移不断增多，在14:00时达到1 d中最大，然后减少，在16:00之后保持平衡状态。

图3 胡椒木叶片不同时间释放的挥发性有机物的总离子流图Fig. 3 The TIC of VOCs released from leaves of Z. piperitum at different times

图4 1 d中不同时段胡椒木叶片挥发性有机物种类的变化Fig. 4 The component numbers of VOCs released from Z. piperitum leaves at different times of a day

在1 d中不同时段，从胡椒木叶片中检测到的挥发性有机物成分的种类和相对含量不相同。8:00检测出的挥发性有机物种类以烷类化合物最多，其相对含量达到76.38%，其中1,1-二甲基-3-甲基-1,3-丁二炔基环丙烷含量最高，为69.07%。 其次为萜烯类和酯类化合物，如β-月桂烯、肉桂酸甲酯、α-石竹烯等。10:00和12:00检测到的挥发性有机物种类以萜烯类和酯类化合物为主，萜烯类化合物中β-松油烯和β-月桂烯含量较高，其中β-松油烯的相对含量都在75%以上；酯类化合物以肉桂酸甲酯和乙酸叶醇酯为主。14:00时检测到的挥发性有机物种类以萜烯类最多，其次为酯类、烷类和酸类，并且出现了醛类化合物；但烷类化合物的相对含量最高，其次为酯类、酸类和萜烯类；主要含有1,1-二甲基-3-甲基-1,3-丁二炔基环丙烷、肉桂酸甲酯、β-月桂烯、油酸和棕榈酸，相对含量分别为46.34%、15.86%、6.82%、5.84%、5.79%。 16:00、18:00和20:00检测到得挥发性有机物种类和相对含量变化不大，主要集中在萜烯类和酯类化合物。1 d中，每个时间段都检测到的化合物有肉桂酸甲酯、(1R)-(+)-α-蒎烯、β-月桂烯、(+)-4-蒈烯、石竹烯、α-石竹烯和棕榈酸。

表3 胡椒木叶片1 d中不同时段挥发性有机物成分及含量分类统计†Table 3 The components and relative contents of VOCs released from leaves of Z. piperitum at different times in a day

从表3可以看出，1 d中不同时段，胡椒木叶片释放的酯类化合物的相对含量呈现先上升后下降的趋势，在18:00时达到最高；萜烯类物质呈现先急剧上升后下降再上升又缓慢下降的趋势，在10:00时最高，14:00时降到最低；烷类物质在8:00和14:00含量较高；酸类物质在14:00含量最高，而后下降；醛类物质从14:00开始出现，呈下降趋势；酮类和醇类物质均在14:00出现最大值。其主要成分的变化趋势如下:肉桂酸甲酯、石竹烯和α-石竹烯的相对含量呈现低—高—低的变化趋势，β-月桂烯呈现高—低—高—低的变化趋势，β-松油烯总体呈现高—低的趋势。

3 结论与讨论

目前国内对胡椒木和花椒属其他植物挥发性有机物的研究多采用水蒸气蒸馏法、超临界二氧化碳萃取法和溶剂提取法[2,14-17]。蒸馏法简单易行，适于难溶或不溶于水的成分的提取；但其属于非活体提取，长时间高温提取会使某些挥发性物质受到破坏；超临界二氧化碳萃取法适用于亲脂性、分子量和极性较小的物质的萃取，而对极性大、分子量太大的物质较难萃取；溶剂提取法是根据相似相溶原理，选择适合的溶剂非常关键，但溶剂中的微量杂质沉淀在提取物中，影响提取物的纯度[18]。通过对比各种提取方法，本研究采用了顶空-固相微萃取采集法，此方法所需样品量少，无需溶剂，操作简化，集采样、萃取、浓集、进样于一体，非常适合芳香植物挥发性成分的研究，已在许多植物挥发性有机物的研究中得到应用[19-22]。

随着季节的变化，胡椒木叶片释放的挥发性有机物的种类在3月份最多，有24种，主要为酯类、萜烯类和酸类物质；其次是6月份，为20种；9月份最少，为8种。前人对植物挥发性有机物释放规律的研究表明，挥发性有机物释放的种类和相对含量与采样时温度、湿度、气孔导度、光照以及蒸腾速率等关系密切[23-27]。3月份光照时间较短，温度都较低，仅为15.9 ℃，此时植物体内合成代谢较慢，生长较慢，因此形成的VOCs种类较少；而随着夏季的到来，光照时间变长，温度逐渐升高，达到30 ℃左右，植物进入生长旺盛阶段，体内有机物合成、代谢加快，其挥发性有机物的种类增多[28-30]。而试验结果显示3月份胡椒木释放的挥发性有机物的种类最多，这似乎与前人的研究结果不一致。但是，通过对比3月和6月胡椒木释放的挥发性有机物的成分发现，叶片在3月份释放的酸类物质达7种，而叶片6月份释放的酸类物质仅2种，且3月份释放的酸类化合物的相对含量仅占总挥发性有机物的2.49%，并不是挥发性有机物的主要成分。酯类和萜烯类化合物是胡椒木叶片释放的挥发性有机物的主要成分，这两大类物质所包含的挥发性有机物的种类随夏季的到来呈现上升趋势；且其主要挥发性有机物肉桂酸甲酯、α-石竹烯、β-月桂烯和石竹烯等的相对含量均随季节呈现低-高-低的变化趋势；与前人的研究结果一致。

同样，1 d中不同时间段外界环境条件的改变也会影响植物的代谢活动，从而影响植物VOCs的合成和释放。试验得出，1 d中，胡椒木叶片释放的挥发性有机物的种类呈现先减少后增多再减少的趋势，在14:00达到高峰，以萜烯类化合物为主。这类化合物的生成受到光照、温度和湿度等环境因子的显著影响，其中大部分萜烯类化合物释放的高峰期在13:00左右[25,31]。14:00采样时温度为34.3 ℃，空气湿度达54.9%，这些外界环境均有利于萜烯类化合物合成酶的活化；同时，植物自身旺盛的光合作用为萜类化合物合成提供充足的碳源和还原力，强烈的蒸腾作用也为化合物的扩散创造了条件[32-33]。植物叶片释放挥发性有机物种类的多少和相对含量的高低与外界环境以及植物自身条件的密切相关，每种挥发性有机物的释放量受哪几种因素的影响尚不明确，这有待后续进一步开展研究。

另一方面，随着科研人员对植物挥发性有机物研究的深入，相关研究结果证实了植物的保健功效得益于自身散发的某些挥发性成分。例如，针叶树释放的萜烯类化合物使人情绪趋于放松状态，使人感觉清新、舒爽和愉悦[34-35]；柠檬油、雪松醇、龙脑和1,8-桉叶油能够降低心率和血压[36]；本研究检测到胡椒木叶片释放的挥发性有机物的主要成分为肉桂酸甲酯、β-月桂烯、β-松油烯、石竹烯等；其中，肉桂酸甲酯具有果香气味，可用于香料和化妆品的制造[37]；β-月桂烯具有降血糖、防癌的功效[38]；石竹烯具有一定的抗菌和消炎作用[39]，同时可用来治疗抑郁及焦虑[40]等。这说明胡椒木叶片释放的挥发性有机物可以起到抑菌及调节人体情绪的作用，是营造保健型彩色园林景观的理想树种。