模拟酸雨和光强交互作用对芒萁光合生理特性的影响

王立竹，张明如，许 焱，伊力塔

（浙江农林大学，浙江 临安 311300）

酸雨（Acid rain）是目前人类面临的严峻环境问题之一，酸雨在一定程度上会对植物产生伤害，如酸雨会导致叶片营养物质流失，造成光合系统损伤，光合作用被抑制[1]；增加植物体内的自由基，使抗氧化酶、保护酶活性下降[2]，导致植物对环境的适应性下降，影响植物正常的光合生理功能[3]；如pH为2.5的酸雨会显著降低刨花楠的最大净光合速率，提高植物的暗呼吸速率[3]，重度酸雨对杉木幼苗的光合能力和地径生长有一定的抑制作用[4]等；但也有学者研究认为模拟酸雨可以提高樟树的最大净光合速率和表观量子效率[5]，促进北美乔松幼苗的生长[6]。光是影响植物生长、存活、分布和更新的重要生态因子[7]，光照是植物生长的必要条件，但是没有任何一种植物能够完全吸收全光照下所有的光能[8]。前人研究表明适当的遮荫可以降低叶片的温度、提高土壤水分含量及空气湿度等[9]；即通过改变植物的生长环境，影响植物光合特性，进而影响植物生长。例如通过遮荫来提高苦丁茶的产量和品质以及茶树的净光合速率[10]，降低崖柏等植物的光补偿点和饱和点等[11]；但也有研究表明过量的光强会引起光抑制，导致植物光合系统受损。例如栽植密度大而冠幅小，叶片处于强光照、高温环境下，因此导致光抑制，进而影响库尔勒香梨的产量和品质[12]。

芒萁Dicranopteris dichotoma为里白科Gleicheniaceae芒萁属Dicranopteris多年生常绿蕨类植物，耐旱、喜酸性土壤、耐瘠薄，多生长于亚热带低山丘陵森林植被的退化区，在马尾松单优群落、杉木以及杨梅园下层形成连续密布的单优层片[13]，表明芒萁可在多种光环境下生长。George等通过控制性试验[14-15]，认为蕨类植物构成的“生态筛”对森林更新过程具有选择性作用。故当芒萁形成单优层片后，会影响低山丘陵退化区植被的演替进程。据此，研究芒萁的生存适应条件可以探究芒萁对森林群落更新的影响。同时，芒萁被称为酸性土壤指示性植物[16]，因此我们推测:芒萁更适应在遮荫环境的酸性土壤中生长。因此拟采取模拟酸雨和光强双因素控制试验，探讨模拟酸雨和光强对芒萁光合生理特征的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于浙江省临安市浙江农林大学东湖校区内，地处浙江省西北部（119°43′39″E；30°15′14″N），属亚热带季风型气候，温暖湿润，光照充足，雨量充沛，四季分明。年均降水量1 463.6 mm，主要集中于7月份。1月的平均气温为3.7 ℃，7月的平均气温为28.5 ℃，最高气温为40.5 ℃，最低气温为-9.3 ℃，年均降水天数160 d，无霜期约241 d[17]，土壤类型为酸性红土壤。

1.2 试验材料

在浙江省临安市境内玲珑山森林公园内选取长势一致的1年生野生芒萁幼苗，于2016年5月栽于高15 cm、直径35 cm的塑料花盆中，盆栽土壤为当地红土壤，每盆一株，放置于实验大棚内，缓苗期保证自然光充足，用自来水浇灌，常规管理。缓苗期2个月后，选取长势基本一致的芒萁幼苗随机分成13组，每组15盆，共195盆（每个棚3个酸液处理组，1个无酸处理组，棚外1个全光对照组CK）。

1.3 试验设计

实验时间为2016年5—9月。参考前人的试验方法[18]，设置4种不同酸雨浓度，即pH分别为3.0、4.0、5.6和7.0的蒸馏水；同时在每种酸雨浓度下设置4个光强梯度（采用遮荫网方式），即21.6%、42.5%、69.8%和100%全光照，其中以pH 7.0的蒸馏水和100%全光照复合处理作为对照CK。

1.4 试验方法

1.4.1 酸雨配制、喷淋方法及光强处理

根据浙江省酸性降水平均离子组成，将H2SO4、HNO3和CaCL2配置成SO42-和NO32-的摩尔比为5∶1的酸液母液，然后将母液用蒸馏水稀释成pH分别为3.0、4.0、5.6的酸液[18]。用黑色尼龙网对大棚进行遮荫处理，分别为一层遮荫、两层遮荫和三层遮荫，利用便携式光照强度测定仪对大棚进行遮荫强度测试，测出光照强度分别为69.8%、42.5%、21.6%。采用喷雾器人工模拟降雨向每盆芒萁幼苗喷淋酸液，喷施酸液的数量及频率根据临安市当月降水量而定（如图1），并平均分配到每周，每周喷淋2～3次。

图1 临安近10年每月平均降水量Fig. 1 The statistical chart of average monthly rainfall in Lin’an for ten years

利用便携式光合仪（Li-6400型，美国LI-COR公司）测定不同处理的盆栽芒萁光响应过程。测定时间为上午9:00—11:00，选择成熟的功能叶片进行测定，每株测3片，共测3株。为保持其它环境因子的稳定性，在测定过程中，选用开放气路，气体流速为0.5 L·min-1，将叶温设置为25 ℃，相对湿度60%左右。将待测叶片在1 500 μmol·m-2s-1光强诱导下20 min以充分活化其光合系统，参考前人对蕨类植物光合曲线的测定[19]，设置12个光强梯度，即 0、10、30、50、100、300、500、800、1 000、1 200、1 500 和 2 000 μmol·m-2s-1，仪器自动记录各光强下的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、胞间CO2浓度（Ci）、气孔导度（Gs）等光合参数。

1.4.2 叶绿素荧光参数的测定

采用非调制式叶绿素荧光仪（Yaxin-1161型，雅欣理仪科技有限公司）进行叶绿素荧光参数的测定，测定前暗适应20 min，选取一片叶片固定在感应区进行测定，每个处理重复测3次。计算每个处理的Fv/Fm，其中Fv为可变荧光，Fm为最大荧光。

1.4.3 保护酶活性等参数的测定

本实验采用硫代巴比妥酸法[20]测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA） 含 量；100T的 试 剂盒（南京建成）测定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性；愈创木酚比色法[21]测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性；考马斯亮蓝染色法[22]测定可溶性蛋白质（Soluble protein）含量。

1.5 数据处理

利用SPSS 19.0统计分析软件对所有的数据进行正态分布和齐次性检验，然后进行单因素方差分析（One-way ANOVA）和描述统计（Descriptive statistics）分析，并用Origin 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 模拟酸雨与光强复合处理对芒萁光合作用的影响

2.1.1 模拟酸雨与光强对芒萁净光合速率的影响

根据图2可知，不同pH值酸雨和不同遮荫强度处理下，芒萁净光合速率随光合有效辐射的增加而呈增大趋势，进而趋于平缓；模拟酸雨同一pH值处理下，芒萁净光合速率在69.8%下得到最大值，在21.6%下得到最小值，说明21.6%光强下会抑制芒萁的光合作用，pH 7.0时，全光对照大于21.6%光强处理小于42.5%和69.8%光强处理芒萁净光合速率，说明适当遮荫会增大芒萁的净光合速率；同一遮荫处理下，不同处理之间的净光合速率存在显著差异（P＜0.05），42.5%和69.8%光强时，芒萁在pH 7.0下净光合速率最大，说明在此实验条件下，此pH值更适合芒萁生长，其次为pH 4.0和pH 5.6，而在21.6%光强时，芒萁净光合速率排序为pH 5.6＞pH 3.0＞pH 4.0＞pH 7.0，由此可见，21.6%光强对芒萁产生光胁迫。此外，从图中可以看出，芒萁叶片净光合速率均在800 μmol·m-2s-1光合有效辐射后趋于稳定，说明此时达到芒萁的饱和光强。

图2 不同模拟酸雨及光强对芒萁净光合速率的影响Fig. 2 Net photosynthetic rate of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.1.2 模拟酸雨与光强对芒萁蒸腾速率的影响

从图3可知，不同pH值酸雨和不同遮荫强度处理下，芒萁蒸腾速率随光合有效辐射的增加呈上升趋势；同一pH值处理下，芒萁蒸腾速率表现为69.8%＞42.5%＞21.6%；均在69.8%光照时取得最大值，说明此时芒萁的光合系统能力较强；同一遮荫处理下，芒萁的蒸腾速率均在pH 4.0酸雨浓度下得到最大值，总体上均高于全光对照处理的蒸腾速率，且在69.8%光照下，全光对照的蒸腾速率最小，说明全光照对芒萁造成了胁迫。

2.1.3 模拟酸雨与光强对芒萁气孔导度的影响

图3 不同模拟酸雨及光强对芒萁蒸腾速率的影响Fig. 3 Transpiration rate of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

根据图4可知，不同pH值酸雨和不同遮荫强度处理下，芒萁气孔导度随光强的增加而增加；同一pH值处理下，芒萁气孔导度在69.8%光强下均大于CK，42.5%光强下与CK差异不大；同一遮荫处理下，21.6%及42.5%光强下，气孔导度变化趋势一致，表现为pH 5.6＞pH 3.0＞pH 4.0，与全光对照相比，在pH 7.0蒸馏水处理下，气孔导度大小为42.5%＞69.8%＞CK＞21.6%，表明光照会影响芒萁气孔开放的大小。

2.1.4 模拟酸雨与光强对芒萁胞间CO2浓度的影响

根据图5可知，不同pH值酸雨和不同遮荫强度处理下，芒萁叶片的胞间CO2浓度随光合有效辐射的增加而降低，均在21.6%光强下取得最大值；同一pH值处理下，芒萁叶片胞间CO2浓度均略低于CK；在pH 7.0蒸馏水处理下，不同光强下芒萁叶片气孔导度大小排序为21.6%＞42.5%＞CK＞69.8%，表明光照对芒萁光合能力有一定的影响；同一遮荫处理下，芒萁的胞间CO2浓度没有明显规律性趋势。

2.1.5 模拟酸雨与光强对芒萁光合参数的影响

由表1中可以看出，最大净光合速率Pmax在pH 7.0、69.8%光强处理时取得最小值，各处理之间差异不显著；表观量子效率AQY在pH 4.0、69.8%光强处理时得到最大值，说明在各处理中，此时的光合能力最强；各处理的光补偿点LCP均显著低于（P＜0.05）CK，说明处理的芒萁对弱光的适应性更强，同时，各处理下的LSP也均小于CK，表明芒萁在CK下耐荫能力较差；暗呼吸速率Rd在CK时得到最大值，说明此时植物消耗的有机质与其他处理较多，但各处理之间没有显著差异。

图4 不同模拟酸雨及光强对芒萁气孔导度的影响Fig. 4 Stomatal conductance of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

图5 不同模拟酸雨及光强对芒萁胞间CO2浓度的影响Fig. 5 Intercellular CO2 concentration of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.1.6 模拟酸雨与光强对芒萁荧光参数的影响

如图6所示，不同模拟酸雨及光强处理下，芒萁叶片Fv/Fm值基本上均显著大于（P＜0.05）CK。pH 5.6酸雨浓度下，Fv/Fm随光照强度的增加而降低，且在42.5%和69.8%光强处理下显著低于（P＜0.05）21.6%光强处理；pH 4.0酸雨浓度下，3种处理的Fv/Fm均显著高于（P＜0.05）对照，且在42.5%光强下取得最小值；pH 3.0酸雨浓度下，3种处理的Fv/Fm均显著高于（P＜0.05）对照，不同处理之间没有显著差异，但均在42.5%光强下取得最小值；pH 7.0蒸馏水处理下，3种处理下的Fv/Fm显著高于（P＜0.05）CK，且在69.8%时取得最大值。

表1 不同处理对芒萁光合参数的影响†Table 1 Photosynthetic parameters of D. dichotoma under different treatments

图 6 模拟酸雨及光强不同处理对芒萁荧光参数的影响Fig. 6 Fluorescence parameters of D. dichotoma underdifferent acid rain and light treatments

2.2 模拟酸雨及光强复合处理对芒萁抗氧化系统的影响

2.2.1 模拟酸雨与光强对芒萁丙二醛含量的影响

如图7所示，pH 5.6浓度的酸雨下，69.8%光强的处理显著增加（P＜0.05）了芒萁叶片的丙二醛含量，42.5%光强处理下芒萁叶片的丙二醛含量最低，表明在此酸雨浓度下69.8%光强会使芒萁叶片膜脂过氧化程度升高；pH 4.0浓度的酸雨下，芒萁叶片3种光强处理下丙二醛含量没有显著差异，随光照强度的增加呈现先降后增的趋势；pH 3.0浓度的酸雨下，3种光强处理之间丙二醛含量均有显著差异（P＜0.05），其中，42.5%光强处理下芒萁叶片的丙二醛含量显著低于（P＜0.05）21.6%和69.8%光强处理下丙二醛含量，21.6%光强处理下的丙二醛含量显著高于（P＜0.05）69.8%光强处理下丙二醛含量，表明在42.5%光强下，模拟酸雨对芒萁幼苗细胞膜伤害程度最小；在pH 7.0蒸馏水处理下，3种不同的光强下芒萁叶片的丙二醛含量均显著低于（P＜0.05）CK，CK的MDA含量分别是21.6%、42.5%和69.8%处理的1.4倍、1.6倍和1.8倍，表明CK下芒萁的膜脂结构和功能产生的伤害，相对比来说对芒萁叶片细胞膜的伤害最大。

图7 不同模拟酸雨及光强对芒萁MDA含量的影响Fig. 7 Contents of MDA of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.2.2 模拟酸雨与光强对芒萁抗氧化酶活性的影响

根据图8（a）可知，pH 5.6和pH 4.0浓度酸雨作用下，3种不同光强处理的芒萁叶片SOD活性组内均没有显著差异，pH 3.0浓度酸雨作用下，69.8%光强下的SOD活性显著高于（P＜0.05）21.6%和42.5%光强下SOD值；在pH 7.0蒸馏水处理下，芒萁叶片SOD活性在42.5%光强下显著低于（P＜0.05）对照及21.6%和69.8%光强，且3种不同浓度酸雨及pH 7.0蒸馏水处理下芒萁叶片SOD活性均在42.5%光强下达到最小值，说明4种处理均对芒萁叶片产生了一定的生理伤害，而且除42.5%光强外，其他光照下产生的胁迫较大，但是胁迫没有超过植物的自我保护范围，植物可以通过提高抗氧化酶的活性从而来清除酸胁迫导致的活性氧。

根据图8（b）可知，pH 5.6和pH 4.0浓度酸雨作用下，21.6%及42.5%光照下芒萁叶片POD活性显著低于（P＜0.05）69.8%光照下POD活性，说明在此酸雨浓度下，69.8%光照处理对芒萁影响较大；而在pH 3.0浓度酸雨下，芒萁叶片POD活性随光照强度的增加而降低，且21.6%光强下显著高于（P＜0.05）42.5%及69.8%光强；在pH 7.0蒸馏水处理下，21.6%光照下的芒萁POD活性显著高于（P＜0.05）CK及42.5%和69.8%光强处理的芒萁POD活性，说明此光强对芒萁产生了胁迫，因此POD活性加大。

图8 不同模拟酸雨及光强对芒萁抗氧化酶活性的影响Fig. 8 Antioxidant enzyme activity of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

2.2.3 模拟酸雨与光强对芒萁蛋白质含量的影响

根据图9可知，3种浓度酸雨作用下，不同的光强处理的蛋白质含量没有显著差异，但均在42.5%光强下取得最小值，表明42.5%光强处理下芒萁过氧化酶积累较小；在pH 7.0蒸馏水处理下，69.8%光强下芒萁叶片蛋白质含量显著高于（P＜0.05）其他光照下的蛋白质含量，而21.6%光照下蛋白质含量显著低于（P＜0.05）其他处理下蛋白质含量。

3 讨 论

图9 不同模拟酸雨及光强对芒萁可溶性蛋白质含量的影响Fig. 9 Soluble protein content of D. dichotoma under different acid rain and light treatments

在相同的酸雨浓度处理下，芒萁在低光照下净光合速率、蒸腾速率及气孔导度均取得最小值，且低于CK，在42.5%和69.8%光强下取得最大值，说明在同一酸雨浓度下，光强会影响芒萁的光合作用，且随着光强的降低光合作用受到抑制，这与其他学者的研究相一致。如张永霞[23]等通过对不同遮荫条件下对罗布麻的光合特性进行研究，指出在50%光照条件下罗布麻叶片在光合速率、蒸腾速率等均高于30%光照处理下的对应值；吕晋慧[24]等人对金莲花的光合特性进行分析得到42.5%的遮荫处理显著促进了金莲花叶片的净光合速率。相反，芒萁的胞间CO2浓度在21.6%光强下取得最大值，说明此时植物的光合能力较弱，此时的净光合速率应降低，与上述讨论相一致。此外，芒萁在pH 3.0酸雨浓度的处下，净光合速率、蒸腾速率及气孔导度依旧随光合有效辐射的升高而增大，说明芒萁可以在酸性甚至强酸性土壤中生存，这与钱崇澎[25]等人的研究结果相吻合。从上面分析中可以看到，各处理下，芒萁基本上均在800 μmol·m-2s-1以上的光合有效辐射下达到饱和，且高于其他蕨类植物的光饱和点[26]。由于植物的光补偿点和光饱和点是评价植物耐荫性重要指标[27]，且根据朱巧玲[28]等人的研究，植物光补偿点和光饱和点均表现为较高水平，那么说明该植物属于阳生植物。由上述分析可知，芒萁在CK处理下的LCP均显著高于其他处理，说明全光照下芒萁对弱光的适应能力较弱，因此可以得出芒萁为喜阳植物，这与陈波[29]等人的研究结果相一致；但在CK处理下的芒萁暗呼吸速率均显著高于其他处理，说明此时由于光照的原因，芒萁自身消耗了过多的有机质，反而不利于芒萁生长，因此可以推断出，虽然芒萁为喜阳植物，但全光照却不利于其生长。

Fv/Fm通常可以检测植物光合机构对外界胁迫的响应[30]，本实验中随着酸雨浓度的增加Fv/Fm在不同的光强下呈上升趋势，这与董莲春[31]等人在不同酸雨梯度下对茶树幼苗的研究结果一致，表明芒萁在适度的酸性条件下光合系统活性不会损伤，相反却有一定的促进用，说明芒萁对酸雨有较强的适应能力；此外，由于在pH 7.0蒸馏水处理中，芒萁在3种不同光强下的Fv/Fm均显著高于CK，说明适当的遮荫环境下更适应芒萁生长。

MDA作为膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量的高低能够迅速反应出植物受到胁迫的伤害程度[32-33]。本实验研究显示芒萁叶片的MDA含量随酸雨浓度的增加即pH值的降低而增大，说明一段时间的酸雨胁迫破坏了芒萁叶片的细胞膜结构，打破了超氧阴离子自由基代谢的平衡，这与郭慧媛[34]等人对毛竹叶片抗氧化酶活性中不同pH值酸雨对毛竹叶片MDA含量的影响结果相一致。酶活性的高低常用来作为植物抗逆性的指标[35]，本实验研究结果显示芒萁叶片SOD及POD活性随酸雨浓度的增加而增大，说明芒萁叶片受到酸雨胁迫提高了植物体内SOD活性，并迅速清除超氧阴离子自由基O2-同时生产大量的H2O2，POD活性随之提高，这与赵栋[36]等人对茶梅在酸雨胁迫下抗氧化酶系统的变化相一致。随着酸雨浓度的增加蛋白质的积累可能是由于芒萁受到酸雨胁迫，而刺激植物体产生大量蛋白质来积累可溶性有机质，提高细胞渗透，以保持细胞正常代谢[37]。此外，不同酸雨及光强下芒萁的MDA及蛋白质含量，SOD和POD活性均在42.5%光强下取得最小值，同时pH 5.6酸雨浓度下的活性值整体最小，且MDA含量在3种光强下显著低于CK，说明芒萁在42.5%光强和pH 5.6酸雨浓度下所受胁迫较小。

4 结 论

综合以上结果可以得到以下结论:（1）在较强的酸性条件及中度光照下（42.5%、69.8%），盆栽芒萁的光合速率并未受到抑制，且在pH 7.0处理下，42.5%及69.8%光强下可以提高其净光合速率等光合指标，具有较高的光饱和点；（2）酸性土壤及适当的光照可以提升芒萁的Fv/Fm，且高于全光照下的Fv/Fm；（3）强酸会提高芒萁MDA及蛋白质含量以及抗氧化酶活性，在相同的酸雨浓度下，42.5%的光照下所带来的胁迫较小。因此在一定酸度范围内，盆栽芒萁属于喜酸性植物；盆栽芒萁具有较强的耐荫性，同时又具有偏阳性的特点。我们的研究结果证实:盆栽芒萁的光强适应范围变化于 -3.281 μmol·m-2s-1至910.667 μmol·m-2s-1范围内。